色谱技术及应用课件.pptxVIP

色谱技术及应用 1 凝胶过滤技术2 离子交换色谱3 疏水色谱4 聚焦色谱5 反相色谱 6 超临界流体色谱 7 羟基磷灰石色谱 8 浇注色谱9 应用Questions12 1 凝胶过滤技术1)、Gel filtration chromatography(GFC)原理操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子(a)，小分子扩散进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。分子筛色谱: 从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt, 组分1-2在V0-Vt之间. 显然，GFC能分离洗脱体积在V0-Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离m 1 凝胶过滤技术分配系数m影响因素：分子量, 分子形状, gel孔径结构；与pH, I, T无关. 2)、凝胶介质对介质的要求：1st 亲水性高；2nd 表面惰性，不发生化学和物理变化；3rd 高稳定性，有较宽的pH和I适应范围；4th 具有一定的孔径分布；5th 机械强度高，耐高压操作，寿命长。 商品化的介质均能满足1-4条的要求。 介质的类型：1st Sephadex2nd Sephacryl 3rd Superose/-dex, Sepharose4th Cellulose5th TSKgel 1 凝胶过滤技术3)、凝胶介质特征参数排阻极限(exclusion limit)：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的M。如，Sephadex G50的排阻极限为30kD。分级范围(fractionation range)：能阻滞组分并且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。如， Sephadex G50的分级在1.5-30KD内。溶胀率/吸水率： 如，Sephadex G50的溶胀率 = 500 ± 30%。 意义:凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150?m之间；硬gel较小，在5-50?m之间。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。床体积(bed volume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如， Sephadex G50的床体积为9-11 cm3/g干胶。空隙体积(void volume)：凝胶之间的空隙体积，即V0。 空隙体积一般用平均分子量在2000KD水溶性蓝葡聚糖(blue dextran)测定。 1 凝胶过滤技术4)、影响因素线速度：1st HW40F凝胶的排阻极限小，在该凝胶中蛋白质的m = 0，故HETP = 2Dz/u (Dz ? udp) = 常数。2nd HW55F凝胶的排阻极限较大，在此，m > 0, HETP ? u; 在u = 0处，直线交于点 2Dz/u。3rd 当u < 0.2 cm/min, NaCl的HETP随流速降低急剧增大。这主要由于分子的扩散影响。 进样体积： 1st 在一定相对料液体积范围内，HETP为常数；2nd 但，之后，HETP随料液相对体积的增加而急剧增大。 3rd 意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的m差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值。料液浓度 依据GFC的原理，tr和HETP与浓度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使HETP极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在2以内。 1 凝胶过滤技术分子量M和分配系数m1st 在GFC分级范围内m与M关系 此时，分离度方程为 方程示：b值越大，即凝胶分级范围越小，Rs越大。2nd 因此，一定料液时，根据组分的M选择分级范围较小的介质，提高Rs和料液的处理量。凝胶的粒径1st dp?, HETP?.故dp?是N?的最佳途径；2nd dp?10倍, 而h和v不变，u?10倍，HETP(=h dp) ?10倍，R?10倍 1 凝胶过滤技术5）、应用1st 分离纯化 M：x0-106， d: 0.x-x00nm之间； 种类：肽、脂质、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。2nd 除热原、过敏原 如青霉噻唑蛋白 – Sephadex G25凝胶柱。 3rd 脱盐/置换buffer 1 凝胶过滤技术4th M测定 原理： 挑选标准蛋白质：cyt C(12500), Mb(16900), 胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500). 条件：在凝胶介质分级范围内. 作图：6）、优点1st 如其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产；2nd 溶质和介质不发生