《基因工程的基本操作程序》教学省赛获奖.ppt

基因工程的基本操作程序 二、基因表达载体的构建与转化 1.基因表达载体的构建步骤 (1)一般用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同的末端。 (2)将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如图： 特别提醒：该过程把三种工具(两种工具酶、一种载体)全用上了，是最核心、最关键的一步，在体外进行。 2.将目的基因导入受体细胞的方法比较 细胞类型 方法 说明 特点 植 物 细 胞 农杆菌转化法 目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→通过农杆菌→进入植物细胞→插入到植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达 经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物 基因枪法 目的基因包裹在微小的金粒或钨粒表面→用基因枪高速射入到受体细胞或组织中→目的基因表达 成本较高，是单子叶植物中常用的基因转化方 植物细胞 花粉管通法 含目的基因的溶液→滴加在柱头上(或用含目的基因的溶液处理花粉粒)→花粉粒吸入目的基因→授粉→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创 动物细胞 显微注射技术 目的基因片段→受精卵的核内→受精卵经胚胎早期培养一段时间后移植到雌性动物的输卵管或子宫内→使其发育成转基因动物 最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法 微生物细胞 感受态细胞法 Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体在缓冲液中与感受态细胞混合→一定温度下促使感受态细胞吸收DNA分子 简便、经济、有效 归纳提炼　 思维激活 1.结合教材P13资料卡分析，用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。 答案　需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。 2.农杆菌转化法利用了农杆菌的什么特性？ 答案　农杆菌中的Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。 3.为什么动物的体细胞一般不作为受体细胞？ 答案　动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。 4.为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？但若通过基因工程生产人的糖蛋白，从细胞器的功能分析是否可用大肠杆菌作为受体细胞呢？ 答案　微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。 5.用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？启动子和终止子与起始密码和终止密码是一回事吗？ 答案　导入到受体细胞的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。不是一回事，启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。 应用示例 1.农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是__________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现________________________。 具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞_______________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_______________ (部位)即可。 解析　一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。 单子叶植物 将目的基因导入植物细胞 染色体的DNA　 T--DNA片段(内部) (2)根据T--DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制______________________(酶)合成的基因。 解析 根据T--DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。 DNA连接酶、限制酶 (3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是___ 类化合物。 解析 植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。 酚 (4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取______________________。(至少写出两种) 解析 植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。 基因枪法、花