珍珠对mc33-elisa细胞增殖分化间质矿化及凋亡的影响.docxVIP

珍珠对mc33-elisa细胞增殖分化间质矿化及凋亡的影响 骨质疏松症（op）是指骨量减少、骨组织微观结构改变、骨脆弱增加、骨折风险增加的全身骨病。目前用于治疗骨质疏松的药物主要分为两大类:促骨形成药物和抑制骨吸收药物, 两者均能减少骨折发生率、增加骨矿密度, 但是相关的不良反应和高昂的费用限制了它们的使用。 珍珠作为一种名贵的中药材, 在我国的应用已有几千年的历史。珍珠粉有很高的药用价值, 主要成分为碳酸钙、蛋白质、水分及包括铁、铝、镁、锌、硒、铜、钾、锰、锶、锗等多种微量元素及多种氨基酸。董娜等利用原子吸收光谱法测定珍珠粉中的微量元素发现, 其中的钙含量最高 (377.084 mg/g) , 是主要成分, 锰、锶、铁、钠的含量也较为丰富, 而锌、锰、铜的含量较少。据资料报道, 珍珠粉中富含的钙元素和多种微量元素, 对骨量减少和骨小梁变细、断裂等病理改变有明显改善作用。本文观察了珍珠粉以及低钙珍珠粉对MC3T3-E1细胞的增殖、分化、矿化和凋亡的作用, 并对其作用机制进行初步探讨。 1 材料和方法 1.1 培养基和试剂 珍珠粉 (浙江长生鸟珍珠生物科技有限公司) ;MTT、Triton X-100 (美国Amresco公司) ;β-甘油磷酸钠、维生素C (美国Sigma公司) ;α-MEM培养基、胎牛血清FBS (美国Gibco公司) ;MC3T3-E1细胞 (中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心) ;碱性磷酸酶 (ALP) 、考马斯亮蓝测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所) ;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 (美国BD Pharmingen公司) 。 1.2 药物处理和组成 1.2.1 合成粉体中钙离子 取珍珠粉用1 mol/L HCl溶解, 模拟人体胃肠道消化过程, 用PBS缓冲液稀释到一定浓度, 作为珍珠粉原液。另取定量珍珠粉原液, 加入硫酸钠溶液, 完全沉淀钙离子, 作为低钙珍珠粉溶液。采用原子吸收光谱法测定珍珠粉和低钙珍珠粉中钙离子浓度。结果显示, 50μg/m L珍珠粉和低钙珍珠粉中钙离子浓度分别为18.81μg/m L和1.89μg/m L, 前者为后者的9.95倍。 1.2.2 不同钙粉浓度对pbs-pcr菌毒的影响 设正常对照组 (Control) , 珍珠粉组 (Pearl Powder, PP) 和低钙珍珠粉组 (Low Calcium Pearl Powder, LCa-PP) 。珍珠粉和低钙珍珠粉分别用PBS缓冲液稀释到一定浓度, 0.45微孔滤膜过滤除菌, 4℃保存。临用前用细胞培养基配成所需浓度 (5μg/m L, 50μg/m L, 100μg/m L) 。 1.3 方法 1.3.1 m培养基 MC3T3-E1细胞用10%FBSα-MEM培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。每2天更换培养基, 待细胞铺满培养瓶时, 用0.25%胰酶消化, 做传代培养。 1.3.2 检测方法及检测 指数生长期的MC3T3-E1细胞按1×104个/m L密度接种于96孔板, 每孔100μL, 10%FBSα-MEM培养液, 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后换以5%FBSα-MEM培养液, 同时按照分组加入5%FBSα-MEM作为Control组, 受试药物PP (5μg/m L, 50μg/m L, 100μg/m L) , LCa-PP (5μg/m L, 50μg/m L, 100μg/m L) , 每组6孔。继续培养24 h后, 每孔加入10μg/m L, 5 mg/m L的MTT, 4 h后小心吸弃培养液, 再在每孔加入150μL DMSO (分析纯) , 于酶联免疫检测仪上570 nm波长处测各孔吸光度值, 结果用OD570表示。实验重复3次。 1.3.3 分组、给药及测药 细胞按1×105个/m L密度接种于24孔板, 每孔1 m L, 10%FBS的α-MEM培养液, 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合80%后, 换以成骨诱导培养基。成骨诱导培养基组成:5%FBSα-MEM培养液, 50μg/m L维生素C, 10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠。同时按照分组加入5%FBSα-MEM作为Control组, 受试药物PP (50μg/m L) , LCa-PP (50μg/m L) , 每组6孔, 连续给药14 d。给药结束后, 吸弃培养液, 加入1%Triton X-100溶液200μL, 置4℃冰箱中放置1h以裂解细胞, 然后按ALP检测试剂盒及考马斯亮蓝蛋白定量法分别测定ALP值和蛋白含量, 并计算出细胞内碱性磷酸酶的活性。 1.3.4 矿化结节染色 MC3T3-E1细胞以1×105/m L密度接种于24孔板, 10%FBSα-ME