辣椒素诱导人肾癌细胞凋亡及其机制的研究.docx

? ? 辣椒素诱导人肾癌细胞凋亡及其机制的研究 ? ? 刘涛 陶皇恒 王刚 方志海 杨中华 王行环 周家杰 肾细胞癌是肾肿瘤中最常见的病理类型（约占 原发性肾恶性肿瘤的90%），位居泌尿系肿瘤第2位（仅次于膀胱癌），占全身恶性肿瘤的2%～3%［1］。早期肾癌预后较好，保留肾单位肾部分切除术和肾癌根治性切除术往往能取得较好的疗效。遗憾的是，肾癌临床表现多变而隐匿，早期不易发现，实际上约1／3的患者在获得确诊时已经发展为肾癌晚期［1］。而另一方面，肾癌对常规放化疗均不敏感，导致肾癌（尤其是晚期肾癌）的临床治疗方案相对缺乏［2-3］。因此，寻找新的、安全而有效的抗肾癌药物迫在眉睫。 辣椒素是辣椒等辛辣食物的主要有效成分，是一种香草酰胺类衍生物，其化学结构式为8-甲基-N-香草基-6壬烯基酰胺（C18H27NO3）。辣椒素对多种疾病（如疼痛［4］、皮肤病［5］、关节炎［6］等）具有广泛治疗效果，其抗癌效果也日益受到关注。但截至目前为止，尚未有文献报道辣椒素对肾癌细胞的作用效果及机制，因此，本课题组研究辣椒素诱导肾癌786-O细胞凋亡及相关分子机制，以探讨辣椒素作为抗肾癌药物的潜能。 材料与方法 一、细胞培养 人肾癌细胞株786-O（购自 ATCC）用含10%血清，100IU／ml青霉素和100μg／ml链霉素的RPMI 1640培养液常规培养（均购至Gibco公司）。 二、MTT检测 按照试剂盒（Corning Incorporated公司）说明书逐步操作：786-O细胞以5×103的密度种在96孔板中，用不同浓度的辣椒素（使用抑制剂辣椒平时，抑制剂较辣椒素提前2h使用，浓度为2μmol／L）处理，每组设置10个孔。分别孵育12、24和48h后，弃去液体，加入20μl的 MTT （5mg／ml，Sigma公司），37℃下孵育4h。然后小心除去上清，加入150μl DMSO。490nm下测定吸光度。 三、活性氧检测 按照活性氧试剂盒（碧云天生物科技有限公司，南通）说明书：先将786-O细胞种植于96孔板（每孔1×104细胞），用不同浓度的辣椒素（使用抑制剂辣椒平时，抑制剂较辣椒素提前2h使用，浓度为2μmol／L）处理24h，然后更换培养液为含有终浓度为10μmol／L DCFH-DA的无血清培养液，避光孵育20min。再用无血清培养液清洗3遍，荧光酶标板读数。 四、细胞凋亡检测 常规培养细胞至50%～70%融合度，加入含不同浓度辣椒素（使用抑制剂辣椒平时，抑制剂较辣椒素提前2h使用，浓度为2μmol／L）的完全培养液。辣椒素孵育达指定时间后，胰酶消化，收集细胞，用含FITC-Annexin V（PharMingen，San Diego，CA）以及PI的缓冲液室温避光孵育5min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。此外，Hochest染色用于显示凋亡形态学变化。前期处理同流式细胞实验，辣椒素处理后，更换培养液为含有10μmol／L Hochest 33258染料的PBS，避光孵育30min，充分洗涤后再倒置荧光显微镜下观察。 五、RT-PCR 786-O细胞总RNA用TRIzol（Invitrogen公司）提取，按反转录试剂盒（Thermo scientific公司）的说明进行反转录。转录条件：预变性94℃／2min；变性94℃／30s，退火60℃／30s，延伸72 ℃／60s，35 个 循 环；延 伸 72 ℃／10min。TRPV1上游引物：5′-TTCCGA GGG ATT CAG TAT TT-3′；下游引物：5′-TGA GCA GGA GGA TGT AGG TG-3′；内参β-actin上游引物：5′-AGA AGG ATT CCT ATG TGG GCG-3′，下游引物：5′-CAT GTC GTC CCA GTT GGT GAC-3′。 六、Western blot 细胞用PBS洗涤2次，1%Triton裂解缓冲液冰上裂解。BCA法测定蛋白浓度。95℃变性10min后，蛋白样品在7.5%、10%、12.5%或15%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，将分离的蛋白电转至PVDF膜。将载有蛋白的PVDF膜用TBST溶液漂洗3次10min，然后与指定抗体共孵育4℃过夜。再次用TBST溶液漂洗3次10min后，与二抗室温下作用2h。漂洗后用ECL显色试剂盒显色，并于暗室内用胶片曝光、显影及定影。所用抗体如下：抗TRPV1抗体（1∶200，＃ACC-030）购至 Alomone Labs公司（Jerusalem，Israel）；抗 GAPDH 抗体（1∶1 000，sc-166574）购至Santa Cruz Biotechnology公司（USA）；抗FADD抗体（1∶1 000，＃2782），抗caspase-3抗体（1∶500，