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云锦杜鹃根系欧石南菌根菌株培养的氮源吸收特性 0 erm真菌h.在发酵植物中的应用 [研究意义]杜鹃植物的根系通常形成欧石南菌根（erm）。ERM真菌在杜鹃花氮获取中发挥重要作用,尤其在营养贫瘠的生境中杜鹃花主要依赖菌根吸收氮源。因此,研究ERM真菌氮营养特性,分析ERM在不同氮源条件下对寄主植物生长的影响,有助于了解ERM作用机制及菌根技术在杜鹃花栽培中的应用潜力,并为ERM生物肥料的研制和推广提供基础依据。【前人研究进展】杜鹃花科植物生境土壤主要矿质营养常以复杂的有机态存在,植物自身难以吸收利用,因此ERM及其真菌有机氮利用特性受到较多关注。Stribley等最先发现了杜鹃花科植物蓝莓(Vaccinium ssp.)ERM具有利用有机残基为氮源的能力。后来研究认为由于ERM真菌,如Hymenoscyphus ericae(Read)KorfKernan,可以产生一系列的酶类,包括蛋白酶类、纤维素酶类、几丁质分解活性酶等,因而可以降解复杂有机质作为营养来源,并能在接种后促进寄主植物对有机氮的吸收。而且不同土壤生境分离的ERM真菌吸收利用有机氮源及其辅助寄主植物氮源吸收的功能存在明显差异。ERM同样也可能影响寄主植物对硝态氮(NO3-)的吸收。试验表明硝态氮可以作为ERM真菌H.ericae生长的惟一氮源。而且接种H.ericae形成ERM后,蓝莓(V.macrocarpon L)根系吸收硝态氮的能力提高。【本研究切入点】云锦杜鹃(Rhododendron fortunei L.)是杜鹃花属常绿无鳞类杜鹃花之一,广泛分布于中国浙江、江西、安徽等地海拔620—2 000 m山脊向阳处或林下,优良的观赏性及抗逆性在同类杜鹃花中表现突出。自然状态下,云锦杜鹃是典型的ERM植物,菌根侵染率较高。已从云锦杜鹃根系中分离到ERM真菌菌株。这些菌株的氮源吸收特性如何,以及中国ERM真菌资源的营养特性值得研究。以前关于ERM氮源营养特性的研究仅关注有机氮或者硝态氮,同时把铵态氮、硝态氮和有机氮作为研究对象的文献很少,而ERM对氮源的选择性在杜鹃花类植物栽培中氮营养选择具有重要意义。【拟解决的关键问题】本试验拟研究云锦杜鹃4个ERM真菌菌株有机氮、硝态氮和铵态氮的吸收利用特性,并分析菌株在不同氮源培养基上对云锦杜鹃接种幼苗生长的影响,筛选菌株培养的适宜氮源,初步探讨ERM效应的氮源利用机理,以期为ERM菌根技术在杜鹃花栽培和繁育应用中奠定基础。 1 材料和方法 1.1 云锦推动erm真菌 供试菌株5个,其中4个菌株是从云锦杜鹃根系中分离得到的,并已经确认为ERM真菌。2个菌株为树粉孢属(Oidiodendron sp.)菌种,分别分离自浙江华顶山和湖南幕阜山森林公园的云锦杜鹃;1个菌株为Cryptosporiopsis ericae,和另一个未知菌株都分离自浙江华顶山森林公园;还有1个菌株,也是树粉孢属菌种(Oidiodendron sp.1),为购自德国的ERM真菌商业菌株。接种幼苗为云锦杜鹃无菌播种幼苗。 1.2 学习方法 1.2.1 氮源浓度的筛选 以无氮源MMN培养基(modified Melin–Norkrans agar)为基础培养基,分别添加(NH4)2HPO4、Ca(NO3)2、精氨酸和牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)4种氮源;氮源的浓度为0.053 g·L-1(MMN培养基含氮量),培养基灭菌前p H 5。用直径为0.3 cm的打孔器在活化好的菌斑上打孔,每个试管中接入3个菌块,设置3个重复。培养温度为25℃,转速为150 r/min。15 d后,取出过滤,在65℃烘箱中烘至恒重,称量干重。 1.2.2 云锦松茸接种苗/苗种培养 无氮源MMN培养基高压灭菌后,并分别加入(NH4)2HPO4、Ca(NO3)2、精氨酸、BSA 4种氮源作为接种苗培养基,并设置无氮培养基对照,调节培养基p H至5。将供试的5个菌株作为菌剂接种云锦杜鹃播种幼苗。选取高度、长势一致的云锦杜鹃无菌播种小苗,接种直径约3 mm的活化菌块,并设置不接菌株空白对照,置于25℃,相对湿度为65%的气候箱内培养,4个月后统计幼苗成活率、观察接种苗根系侵染率、测量植株干重。 1.2.3 菌根感染率检测 接种5个月后检测菌根感染率,菌根感染率采用锥虫蓝染色法进行检测,在光学显微镜下观察幼根表皮及皮层细胞中是否有菌丝结或菌丝,并估算菌根感染率。 菌根感染率=菌根感染的根段长度/检查的菌根根段总长度×100% 2 结果 2.1 erm真菌在不同氮源培养中的感染情况 云锦杜鹃接种幼苗根系锥虫蓝染色压片检测结果显示,5个ERM菌株在4种氮源和对照培养基上均能与云锦杜鹃根系形成菌根结构。ERM真菌在有机氮源培养中侵染率较高,无机氮源培养基中较低,