SN_T 2695-2010杀鲑气单胞菌的检验操作规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2695—2010杀鲑气单胞菌的检验操作规程Protocol of detection for Aeromonas salmonicida2011-05-01实施2010-11-01 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局玛练 SN/T 2695-2010前 言本标准按照GB/T 1.1一2009 给出的规则起草。本标准参照了美国渔业协会的《鱼类某些病原的检测和鉴定程序》（Procedures for the Detectionand Identification of Certain Fish Pathogens)2006 版中痧疮病(Furunculosis)一节本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张立怀、岳志芹、陈本龙、霍蕾、王建华、侯艳梅。 SN/T 2695--2010杀气单胞菌的检验操作规程1 范围本标准规定了杀鲑气单胞菌的检验程序。本标准适用于进出口鱼苗、幼鱼和成鱼的检疫。规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。瓦是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3设备材料3.1　材料3.1.1胰蛋白陈大豆蛋白陈琼脂(TSA)：见附录 A.1,实验用水应符合GB/T6682规定。3.1.2 胰蛋白陈大豆蛋白陈血琼脂(TSA-B):见附录 A.2。3.1.3脑心浸液琼脂(BHIA):见附录 A.3。3.1.4脑心浸液血琼脂平板(BHIA-B)见附录 A,4。3.1.5 胰蛋白陈大豆蛋白陈肉汤TSB):见附录/A.5。考马斯亮蓝(CBB):分析纯.7微量生化反应管。3.1.8特异性抗血清。3.2设备3.2.1PCR 仪。3.2.2电泳仪。3.2.3凝胶成像系统。3.2.4生化培养箱：一5℃～50℃±1℃。3.2.5生物安全柜。3.2.6解剖器械。4样品的采集4.1无临床症状鱼，无菌采集其肾、肝、脾等。4.2对于体表有临床症状的鱼，可以采集其病灶深处的组织。 SN/T 2695--20105细菌分离鉴定5.1样品的接种用拭子或接种环将无菌操作采集的组织在 TSA 或 BHIA上划线。推荐接种在相应血琼脂平板TSA-B或BHIA-B上，于20℃～25℃培养 48h。从金鱼、鲤鱼等病鱼的病灶部位分离时，用拭子或接种环取样接种到 TSA-B或 BHIA-B上，于 20℃～25℃培养 48 h。为便于区分有毒力杀鲑气单胞菌的特异性菌落，可在培养基中加人0.1%的考马斯亮蓝（CBB)。杀鲑气单胞细菌在含 0.1%CBB的TSA或BHIA培养基上为深蓝、深紫色易碎的菌落，无毒力的菌株在该平板上为无色的菌落。5.2杀鲑气单胞菌的初步判定杀鲑气单胞菌菌体为革兰氏阴性短的(0.8 μm～1.3μm)×（1.3μm～2.0 μm)杆菌或球杆菌,两极浓染。无运动性,色素氧化酶绝大多数阳性。大多数产生弥散性棕色色素，发酵葡萄糖。在 TSA-B或BHIA-B上，菌落大多数溶血。符合上述特征的细菌可初步判定为杀鲑气单胞菌。5.3玻片凝集试验初步判定为杀鲑气单胞菌的菌株，可以用杀鲑气单胞菌的抗血清进行玻片凝集试验。在干净的载玻片上,加一滴生理盐水和一滴抗血清,取一环细菌分别在生理盐水和抗血清中混匀,3 min 内观察是否出现凝集。如果细菌在生理盐水中不凝集，在抗血清中凝集判定为杀鲑气单胞菌血清凝集阳性。如果细菌在生理盐水中凝集，则该菌为自凝菌株，不适用本试验鉴定。5.4细菌的 PCR鉴定5.4.1引物杀鲑气单胞菌 VapA基因扩增的参考序列参见附录 B。按照表 1设计引物。表 1 PCR引物序列PCR产物大小靶基因引物序列号引物序列AP-15-GGCTGATCTCTTCATCCTCACCC-3(1085-1108)表面阵列蛋白421 bpAP-2基因(VapA)5′-CAGAGTGAAATCTACCAGCGGTGC-3(1505-1482)5.4.2模板的制备对于分离的菌株，采用粗提的DNA进行鉴定。将平板上的菌落取1接种环，加到200μL的无菌去离子水中,摇匀后，在95℃热处理5min，置冰上冷却。13000g离心30 s,取上清液用于检测。用已知杀鲑气单胞菌菌株作阳性对照，用无菌去离子水作阴性对照。细菌DNA的提取也可以采用等效试剂盒按说明书进行。5.4.3 DNA 扩增采用 20 μL反应体系：2 SN/T 2695—20102 μL10XPCR缓冲液2 μLMgCl2(25 mmol/L)dNTP混合物(10 mmol/L)2 μL2 μL引物 A