DB37_T 3319-2018水貂、狐和貉犬瘟热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法.pdf

ICS 65. 020. 30B41DB37山長东省地方标准DB37/T3319—2018水貂、狐和骆犬瘟热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法Real-time fluorescent PCR for detecting of distemper virus and other 1O viralpathogens of mink, fox and raccoon dog2018-06-12发布2018-07-12实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3319—2018前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准的附录为资料性附录。本标准由山东省畜牧善医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、山东大学生命科学学院、威海市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：王贵升、王金宝、田夫林、张鹤晓、崔凯、张月、张华杰。- DB37/T 3319—2018水貂、狐和骆犬瘟热病毒等1O种病毒性病原实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了水貂、孤和犬癌热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法。本标准所规定的实验室检测方法适用于水貂、弧和路的犬蕴热病毒、细小病毒、冠状病毒、轮状病毒、星状病毒、阿留申病毒、杯状病毒、博卡病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒等10种病毒的灾光PCR检测方法，其他动物参考。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法3缩略语荧光PCR实时荧光聚合酶链式反应Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环圈数DNA脱氧核糖核酸RNA核糖核酸Taq酶TaqDNA聚合酶PBS磷酸盐缓冲生理盐水4试剂和材料4.1灾光定量PCR检测仪及配套反应管（板）。4.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。4.3混匀器，4.4恒温水溶锅。4.5冰箱（2C8℃和-20C两种）4.71.5mL离心管（无核酸酶）。4.8DNA\RNA核酸提取试剂等。样品的采集与前处理 DB37/T 3319—2018采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须赋一次性手套。5. 1取样工具5. 1. 1棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf管。5.1.2所有上述取样工具必须经（121土2）C，15min高压灭菌并烘干或经160℃C干烤2h。5.2采样方法5.2.1拭子样品a)咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上聘来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。然后将拭子插入到装有1.0nlLPBS无菌Eppendorf管中，编号备用。b)肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门回刮3次～5次，取排泄物。然后将拭子插入到装有1.0mLPBS无菌Eppendorf管中，编号备用。5. 2. 2内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和锻子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mLPBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。5.2.3血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。5. 3存放与运送采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h：若需长期保存，须放置-70C以下冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温设施加冰密封，尽快运送到实验室。6引物及探针引物及探针见表1“荧光PCR方法的引物及探针”表1荧光PCR方法的引物及探针RNA 病毒FGCAAGCGAGGATTGAGGGTAT犬癌热病毒RGGCCTATGGGACACACTCAAAProheFANCACCGACCATCCAGACGTTGCTCCTBHQFTCCAGGCATTTGAGTATGCC星状病毒CCACATAATCCTGGGGGAProheFAMCGGGAGTCGTGGGACBHQFTGGGAC(T) TATCCT (A) AAG (A) TGTGA冠状病毒RTAA (G) CACACAACNCCATCATCProbeFACGGGAGTCGTGGGAC-BHQCTGACTTCAAATTTCATCTC杯状病毒TGGGAATTAAGTCAGAGGProbeFANATCTATGCTCACTCATGGATCTGTCBHQFTTTATAGATAATGTATGTATGGATG轮状病毒RCCAATTCTCAATGTAATCAGProheFAMAATAGCCAGAGAATCAGAACGAA BHQ细小病毒CGTCTACACAAGGGCCATTTARCCATGTTGTCTA