NY_T 3640-2020CN葡萄品种鉴定 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.01B 05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T3640—2020葡萄品种鉴定SSR分子标记法Identification of grape cultivars using SSR markers method2020-07-27发布2020-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3640—2020附录B(规范性附录)液配制B.1DNA提取溶液的配制DNA提取溶液的配置使用双蒸水。B.1.11mol/L氢氧化钠溶液称取40g氢氧化钠，落于800mL水中，冷却至室温后，定容至1000mL，称取186.1g乙二胺四乙酸二销盐，加人800mL水，再加人20g氢氧化钠，搅拌。待乙二胺四乙酸二钠盐完全落解后，冷却至室温，再用氢氧化钠液(1mol/L)准确调pH至8.0，定容至1000mL，在103.4kPa(121C)条件下灭菌20min，B.1.30.5mol/L盐酸(HCI)溶液量取25mL浓盐酸于瓷杯中，加人少量水需释，混勾冷却至室温后，用玻璃棒引流至容量瓶中，再加少量水清洗烧杯后用玻璃棒引流至容量瓶中，反复几次后，加水定容至500mL，上下颠例混勾后，转到广口瓶中。B. 1. 4称取60.55gTris碱溶于约400mL水中，加盐酸溶液（0.5mol/L)调pH至8.0.加水定容至500mL,在103.4kPa(121C)条件下灭菌20minB.1.52%(W/V)十六烷基三甲基演化铵(2×CTAB)溶渡分别称取20g十六烷基三甲基液化铵、81.816g氧化钠和20g聚乙烯吡咯烷酮于约700mL水mol/L,pH 8.0),加水定容至1000 mL，B.1.65 mol/L NaCI 溶液称取292.2g氟化钠，溶于750mL水中，在磁力揽拌器上搅拌溶解，加水定容至1000mL，在103.4kPa灭菌 20 min。B. 2PCR扩增溶液的配制PCR扩增相关溶液的配制使用双蒸水。B.2.1SSR引物移释开盖前解时离心10s，按说明书分别配制前引物和后引物终浓度均100μmol/L的储销存减，各取10pL加90pL双蒸水至终浓度10μmol/L的工作液，B.3变性聚丙炜酰胺凝胶电泳相关溶液的配制变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制使用双蒸水，B.3.130%丙炜嵌胺溶液(W/V)分别称取290g丙烯醛胺和10g甲叉双丙烯酰胺溶于约800mL水中，加水定容至1000mL，置于棕色瓶中4℃储存。B.3.26%变性PAGE胶(W/V)A NY/T 3640—2020甲基乙二胺.加水定容至60mL，B.3.3亲和硅烷工作液吸取1mL无水乙醇，加人10μL象和硅烷和10μL冰醋酸，混匀。B. 3. 4剥离硅烷工作液量取2mL的二甲基二氯硅烷，加8mL的三氧甲烷，混匀。B.3.510%过硫酸铵溶液(W/V)称取0.1g过硫酸铵溶于1mL水中。B.3.610×TBE缓冲液分别称取108g三羟甲基氨基甲烧和55g需酸溶于约800mL水中，加人37mL乙二胺四乙酸二钠落液(0.5mol/L)，加水定容至1000mL，B.3. 75XTBE缓冲液量收500mL的10×TBE缓冲液，加水定容至1000mL，B.3.81×TBE缓冲液量取500mL的10XTBE缓冲液，加水定容至5000mL，B. 4银染溶液的配制银染溶液的配置使用蒸馏水，B. 4. 1固定液量取100mL冰醋酸.加水定容至1000mLB.4.2染色液称取1g硝酸银，溶于1000mL水中。B. 4. 33显影液称取10g氢氢化钠游于1000mL水中，用前加2mL甲醛。 NY/Tc(规范性附录）30对引物名单及序列30对引物名单及序列见表C.1。表 C. 130对引物名单及序列引物名称引特类型染色体引物序列(5'→3")P01VVMD28核心引物3F, ACAATTCAATGAAAAGAGAGAGAGAGAR; TCATCAATTTCGTATCTCTATTTGCTGP02VVMD82核心引物4F:GGAAAGATGGGATGACTCGCR, TATGATTTTTTAGGGGGGTGAGGP03VVMDe7核心引物5F; TACCAGATCTGAATACATCCGTAAGTR: ACGGGTATAGAGCAAACGGTGTPo4ViZAG79核心引物5F; AGATTGTGGAGGAGGGAACAAACCGR: TGCCCOCATTTTCAAACTCCCTTCCPO5VVMD7核心引物7F,AGAGTTGCGGAGAACAGGATR:CGAACCTTCACACGCTTGATP06VtZAG62核心引物7F; GGTGAAATGGGCACCGAACACACGCR;CCATGTCTCTCCTCAGCTTCTCAGCP07VVM