一种外泌体miRNA的定量检测方法[发明专利].pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 105063209 A (43)申请公布日 2015.11.18 (21)申请号 201510488030.6 (22)申请日 2015.08.10 (71)申请人 北京吉因加科技有限公司 地址 102206 北京市昌平区北清路生命科学 园北大医疗产业园2号楼5层 (72)发明人 赵美茹 吕小星 易鑫 管彦芳 刘涛 杨玲 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) 权利要求书3页 说明书8页 序列表1页 附图1页 (54)发明名称 一种外泌体miRNA的定量检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种外泌体 miRNA 的定量检测 方法，包括外泌体总RNA提取、3’端和5’端特异性 唯一标签接头连接、反转录合成 cDNA 并进行 PCR 扩增、miRNA 文库的筛选纯化与上机测序、纠错算 法的信息分析等步骤。本发明方法基于特异性的 唯一标签接头的标记，对每个原始模板进行区分， 避免了扩增时分子间存在的偏好性，可以精确检 测低于10拷贝以下的miRNA分子，且特异性高，可 用于肿瘤源性的外泌体 miRNA 的检测，神经退行 性疾病、心血管疾病，生育健康等领域的检测，可 为疾病的早期筛查提供依据，还可应用于其他小 RNA 精准定量检测领域。具有广阔的应用前景和 市场价值。 A 9 0 2 3 6 0 5 0 1 N C CN 105063209 A 权 利 要 求 书 1/3页 1.一种外泌体miRNA的定量检测方法，包括以下步骤： (1)外泌体总RNA的提取； (2)3’端和5’端特异性唯一标签接头连接； (3)反转录合成cDNA并进行PCR扩增； (4)miRNA文库的筛选纯化与上机测序； (5)纠错算法的信息分析。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的特异性唯一标签接头连接 是指在常规miRNA接头的基础上添加了8个随机的碱基N以及3个固定碱基CGA。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)在RNA的3’端连接特异性唯一 标签接头的序列为：CGANNNNNNNNAGAUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCAGUCAC；在5’端连接特异 性唯一标签接头的序列为：UACACUCUUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA。 4.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤 (2) 特异性唯一标签接头连接完成 后，去除溶液中的连接缓冲液、多余的盐离子及其他杂质，得到与 5’端和 3’端连接唯一标 签接头的RNA。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)是将5’端和3’端连接唯一标签 接头的RNA反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，加入测序引物进行PCR；反转录引物序列 为GTGACTGGAGTTCAGACGTGT。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR所用的测序引物序列为： 上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT； 下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CT； 其中xxxxxxxx为index标