细菌与酵母表面展示技术.ppt

原理 酵母细胞表面展示技 术是近年来发展较快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白) 与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞， 利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面。 第十二页，共二十页，2022年，8月28日 简介： 酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立以后发展起来的展示系统。酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物的细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示具有优越性。酵母细胞颗粒大，可用流式细胞仪进行筛选和分离。目前报道的两种酵母展示系统分别以α-凝集素作为融合骨架。 第十三页，共二十页，2022年，8月28日 1.目的蛋白-α-凝集素表面展示系统 此系统将目的蛋白作为N端，与α-凝集素C端部分融合，目的蛋白经α-凝集素展示酵母细胞表面。α-凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发挥作用。 迄今，已有多个应用α-凝集素的C端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是α-半乳糖苷酶。 第十四页，共二十页，2022年，8月28日 第一页，共二十页，2022年，8月28日 定义：细菌表面展示技术是利用基因工程手段将某一蛋白或短肽段（靶蛋白）与微生物外膜蛋白（载体蛋白）以融合蛋白的形式呈现在细胞表面。 第二页，共二十页，2022年，8月28日 外源蛋白与载体蛋白结合方式 C端融合 (N端锚定在外膜) N端融合 (C端锚定在外膜) 夹心融合(有些蛋白本身具有信号肽序列及锚定于外膜的序列，内部合适位点插 入外源蛋白) 第三页，共二十页，2022年，8月28日 细菌表面展示系统 传统：细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位（如菌毛、鞭毛等） 近年：冰晶核蛋白、自体运转蛋白、S2层蛋白等 每种展示系统都有自身的缺点（如展示蛋白大小的限制、错误定位、形成包涵体、外膜不稳定等），因此需要开发新的系统，以进一步优化表面展示系统。 第四页，共二十页，2022年，8月28日 早期研究多集中在革兰氏阴性菌。原因是遗传背景清楚，便于控制蛋白展示。 但是从应用上来看，革兰氏阳性菌的某些特性更适合于表面展示。 如下表： 第五页，共二十页，2022年，8月28日 缺点：转化率低，限制构建较大容量的肽库；一些革兰氏阳性菌分泌大量蛋白酶，这会给应用带来麻烦。 表面锚定机制 外源蛋白插入数 展示蛋白通过膜层 细胞壁 革兰氏阴 性菌 有 较短的片段 质膜层，并与外膜正确结合 较薄 革兰氏阳 性菌 有 多达几百个 只需通过单个质膜层 较厚，坚固易操作 第六页，共二十页，2022年，8月28日 细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪或流式细胞筛选仪，是非常有效的高通量筛选方法。 优点： 1、 能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。 2、目前唯一能够定量检验单细胞水平和大量突变体催化活性的方法。 3、定量分析酶活性 4、同时检测多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。 与噬菌体相比：细菌表面展示技术在疫苗应用上具有独特优势；进行更快速更高效筛选 第七页，共二十页，2022年，8月28日 与传统的生物陶选技术相比，荧光激活细胞筛选仪具有以下特色①高富集比②高阳性率③避免“亲和效应” 第八页，共二十页，2022年，8月28日 基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白细菌表面展示 冰核蛋白是丁香假单胞菌的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成，它通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表面呈现。 狂犬病毒糖蛋白是病毒与宿主细胞结合的配体，介导病毒与靶细胞结合。而且是狂犬病毒的主要保护性抗原，能刺激机体产生抗体，保护机体抵抗病毒感染。 方法： 1 冰核蛋白N末端序列的PCR扩增 2 狂犬病毒糖蛋白序列的PCR扩增 3 重组表达载体的构建 4 重组载体的表达（可以导入大肠埃希菌培养、菌体裂解） 5 蛋白表面展示的初步鉴定（结合ELISA，分光光度法鉴定重组蛋白是否成功展示在细胞表面） 第九页，共二十页，2022年，8月28日 综上所述，细菌表面展示系统灵活多样，操作简便，在多个领域显示出广泛的应用前景，随着新的载体系统的发展和其自身的不断完善，细菌表面展示技术必将在实践中发挥更大的作用。 第十页，共二十页，2022年，8月28日 酵母表面展示技术 第十一页，共二十页，2022年，8月28日