猪瘟耐热活疫苗节能冻干曲线的优化研究-《江苏农业科学》(2020年5期).docx

龙源版权所有 猪瘟耐热活疫苗节能冻干曲线的优化研究作者：左晓昕 赵艳红 邓碧华 牟和平 胡来根 宋伟 吕芳 卢宇 侯继波来源：《江苏农业科学》2020年第05期 摘要： 猪瘟疫苗真空冷冻干燥工艺，可减少冻干对制品活性的影响，降低制品冻干过程的耗能，缩短冻干周期，故研制安全、耐热、节能的猪瘟减毒冻干疫苗极为重要。选用甘露醇、甘氨酸等成分设计猪瘟耐热保护剂配方，通过间接免疫荧光法比较制品在37 ℃、10 d的冻干和耐热损失，并用兔体热反应法复核。检测优化配方的共晶点和塌陷温度设计冻干程序，比较不同预冻方式对猪瘟耐热疫苗冻干的影响，调整冻干周期。猪瘟耐热保护剂配方A-4的冻干和耐热损失最小，分别为0.30 lg和0.45 lg。根据制品的共晶点-27.51 ℃，对预冻方式筛选，发现快冻冻干和耐热损失最小，分别为0.17 lg和0.38 lg，根据塌陷温度-24.3 ℃，成功将冻干曲线缩短至24 h。调整后的配方可使猪瘟活苗在 37 ℃ 保存 15 d、45 ℃保存7 d;内毒素和动物试验表明该疫苗安全、无副反应。上述结果表明，试验成功筛选出猪瘟耐热保护剂配方A-4，在保证疫苗质量的前提下优化冻干曲线，调整后的保护剂配方保证疫苗耐热性能，安全无副反应。 关键词： 猪瘟病毒;耐热保护剂配方;冻干工艺;耐热性能;安全性 中图分類号： S859.79+7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2020）05-0156-06 猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的急性、接触性传染病，在各国均有暴发疫情，尤其是东南亚地区，呈散发性且流行范围广的特点[1]。猪瘟作为我国重大动物疫病，已经在国家中长期动物疫病防治规划中被列为优先防治的动物疫病[2]。 疫苗是控制猪瘟的重要手段，我国相继用4株猪瘟病毒诱导猪瘟发病，并成功筛选出能够减少对猪的致病能力但能保存免疫原性的猪瘟病毒，即猪瘟兔化弱毒疫苗C株。CSFV增殖方法多样，目前在生产上多在猪睾丸细胞和牛睾丸原代细胞上扩繁，生产工艺成熟。但是该疫苗的耐热性差，极易失活[3]，在生产后期必须要添加一些保护剂，并进行真空冷冻干燥。但是，目前市场上的猪瘟冻干活疫苗在传输中仍无法脱离冷链环境，需要在 -15 ℃ 以下保存[4]，现有疫苗的冻干工艺周期较长，一般在42～50 h，极大增加生产的成本[5]。在近期研究中，有报道指出，蔗糖、甘氨酸、表面活性剂等复合组方能够延长腺病毒在4 ℃和室温的保存期[6-7];使黄热病毒在4 ℃下可保存11周左右[8]。该复合组方在猪瘟活疫苗上也有应用，使用甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖等能够使疫苗在2～8 ℃保存2年，在37 ℃保存10 d耐热损失在0.9 lg，该复合组方安全、无副反应，避免了外源蛋白给动物带来的过敏反应[9-10]，但目前这些配方对不同细胞培养的CSFV保护效果报道较少。 耐热保护剂配方与冷冻干燥工艺相互配套，保护剂是冻干工艺的基础，合理的保护剂配方和适宜的冻干曲线是制品顺利冻干的保证。在保证质量的前提下需要减少能耗、降低成本。冻干工艺主要分为预冻阶段和干燥阶段，在不同阶段需要通过参考制品的热参数，如共晶点、塌陷温度等进行设计。其中，塌陷温度是在真空冷冻的过程中测得的，能够真实反映制品的特性[11]。当温度超过塌陷温度会造成制品底部熔融、塌陷、萎缩，损害干燥制品的多孔结构，增加残余水分，降低生物制品的效价[12]。因此，以塌陷温度作为临界温度，可以提高升华干燥速度，缩短冻干时间。 本研究针对猪瘟冻干工艺周期长、耗能高及猪瘟耐热保护剂配方通用性等问题，以吕芳等的无明胶、无蛋白的猪瘟耐热保护剂配方[8]为基础，添加甘露醇、甘氨酸等成分，通过间接免疫荧光法筛选耐热保护组方。将筛选的配方分别和猪睾丸、牛睾丸细胞冻干，初步对配方的通用性进行探索。并根据共晶点和塌陷温度科学设计冻干程序，获得耗能低、冻干周期短的冻干曲线，研制安全、耐热、节能的猪瘟减毒冻干疫苗冻，为猪瘟耐热保护剂配方在实际生产上的应用提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 猪瘟兔化弱毒株（猪睾丸原代细胞毒）和ST细胞，均由成都天邦生物制品有限公司提供;猪瘟兔化弱毒株（牛睾丸原代细胞毒），由南京天邦生物制品有限公司提供;甘露醇、甘氨酸等，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;DMEM培养基、谷氨酸钠等其他试剂耗材，均购自Sigma公司;鲎试剂盒、细菌内毒素标准品（0.25 EU/mL）和检查用水，均购自湛江安度斯生物有限公司。 1.2 试验仪器 冻干机（美国Virtis，Advantage Plus型号）;37 ℃ 和45 ℃恒温干燥箱（上海新苗医疗器械制造