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基因工程的基本原理A重组DNA技术的理论基础B基因的分子生物学C基因工程的基本原理D基因工程的支撑技术2 基因工程的基本原理A重组DNA技术的理论基础19世纪中孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学20世纪初摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学1944年艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA分子遗传学1953年沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学1973年伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体外拼接基因工程2 基因工程的基本原理B基因的分子生物学2 基因工程的基本原理C基因工程的基本原理提高外源基因的剂量——分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、 增强子、操作子、终止子、上游调控序列等——分子生物学原理 修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序 列、mRNA非编码区、密码子等——分子生物学原理 基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产——生化工程学原理 2 基因工程的基本原理D基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术 基因工程的基本条件A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的载体C用于基因转移的受体菌或细胞3 基因工程的基本条件A用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用hsd R：编码限制性核酸内切酶hsd M：编码限制性甲基化酶hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind II和Hind III 限制性核酸内切酶限制修饰多功能单功能双功能辅助因子ATP Mg2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG限制性核酸内切酶的类型主要特性I 型II 型III 型蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名Haemophilus influenzae d嗜血流感杆菌d株H i n d III H i n d III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构EcoR I的切割位点EcoR I的识别序列5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’EcoRI 37 ℃退火 4-7 ℃OHP5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’POHPstI等产生的3‘粘性末端5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’PstI 37 ℃5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’退火 4-7 ℃OHP5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’POH5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’PvuII等产生的平头末端5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’PvuII 37 ℃限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.50 - 50 mM 低