第七章发酵工业制药part.ppt

重组质粒的转化 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第三十页，共四十二页。 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 主要应用： 1. 提高次级代谢产物的产量 2. 改进代谢产物的组分 3. 改进菌种的生理性能 4. 产生新的代谢产物 第一页，共四十二页。 ㈠ 提高次级代谢产物的产量 基因工程技术提高抗生素产量的主要手段 增加限速酶的基因拷贝数 增加正调节基因，去除负调节基因 增加抗性基因的拷贝数 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第二页，共四十二页。 1.增加限速酶的基因拷贝数 原理： A B C D E （代谢产物） Ea Eb Ec Ed 限速酶 Rate-limiting Bottleneck 例1：起始原料 ACV三肽 异青霉素N 青霉素 Ea Eb Ec α-aminoadipic acid L-cvstcinc Ea：ACV合成酶 Ec：异青霉素N酰基水解酶 L-valinc Eb：异青霉素N合成酶 青霉素酰基转移酶 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第三页，共四十二页。 异青霉素N合成酶对 P.chrysogenum 青霉素产量的影响 菌株 原始菌株 低产菌株 Wis 54-1255 高产菌株 AS-P-78 IPNS的基因 拷贝数 1 ---- 9-14 mRNA 1 ---- 32-64 青霉素产量 100% 导入带IPNS的基因片段 140% 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第四页，共四十二页。 增加IPNS基因提高青霉素产量 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第五页，共四十二页。 例2. 头孢菌素C的生物合成的限速酶 在头孢菌素C的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素C外，在发酵液中还积累另一种产物-青霉素N。 问题：积累中间产物-青霉素N 原因：下一步反应为限速酶反应 解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因 结束：使头孢菌素C的产量提高25-50%，积累的青霉素N消失。 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第六页，共四十二页。 增加限速酶基因提高头孢菌素C的产量 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第七页，共四十二页。 增加限速酶的其它例子-3： 例3.十一烷基灵菌红素 产生菌：天蓝色链霉菌 S.colocolor A 3(2) acetyl CoA 构建重组质粒（带甲氧基转移酶） Polyketide pathway 转化到氧甲基转移酶缺陷变株 转化菌株 十一烷基灵菌红素产量提高5倍 S-酰苷甲酰氨酸 氧甲基转移酶 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第八页，共四十二页。 增加限速酶的其它例子-4： 例4. 泰洛星 （Tylosin） 产生菌：氟式链霉菌 （S.fradiae） acetyl CoA + malony CoA Polyketide pathway 构建重组质粒（带甲氧基转移酶） 转化到氟式链霉素（ S.fradiae ） 泰洛星（Tylosin）产量显著提高 甲氧基转移酶 大菌素（macrocin） Tylosin 转化菌株 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 第九页，共四十二页。 2.增加正调节基因，去除负调节基因 调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正调 节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因的转 录。 将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株中， 由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水平的表 达，提高了代谢产物的产量。 反之，对于负调节基因，通过基因工