第十四章基因工程.ppt

在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 3. 同聚物加尾连接 第九十五页，共一百四十一页。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 5′ 第九十六页，共一百四十一页。 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 4. 人工接头(linker)连接 第九十七页，共一百四十一页。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 第九十八页，共一百四十一页。 受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 第九十九页，共一百四十一页。 1、显微注射法 (Microinjection technique) 在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有10%是整合外源基因的转基因动物。 第一百页，共一百四十一页。 2、电穿孔法 在高压电场的短暂作用下，细胞膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通过此孔洞进入胞内。 方法适应不同细胞如细菌、酵母、植物及动物细胞。 需电穿孔仪。 第一百零一页，共一百四十一页。 3、DNA-磷酸钙共沉淀法 将DNA与CaCl溶液混合，再缓慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。 小心地将颗粒加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，使DNA被靶细胞摄取。 更换培养液使外源DNA在细胞中表达，筛选转化细胞或分析外源基因的表达量。 第一百零二页，共一百四十一页。 4、DEAE-右旋糖苷法 该法先用来促进病毒DNA导入，后来发展为一种哺乳动物细胞的基因转移方法。 方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物处理细胞。 通常只用于克隆化基因的瞬间表达，不用于细胞的稳定转化。它对BSC-1，CV-1和COS细胞转染较好，因此应用上有限制。 第一百零三页，共一百四十一页。 5、逆转录病毒载体 逆转录病毒是一种RNA病毒，基因大小为3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍体基因，即含有两个相同的RNA分子，有典型的真核mRNA结构（包括帽子和尾巴）。 第一百零四页，共一百四十一页。 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法:原位杂交、Southern印迹等。 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 （五）重组体的筛选 第一百零五页，共一百四十一页。 (插入失活法) 抗药性标记选择 第一百零六页，共一百四十一页。 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 第一百零七页，共一百四十一页。 插入失活法-α互补 第一百零八页，共一百四十一页。 X-gal 蓝色化合物 ?-半乳糖苷酶 Lac-Z基因 蓝白斑筛选 第一百零九页，共一百四十一页。 α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18 第一百一十页，共一百四十一页。 根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源基因的插入，导致LacZ失去活性，菌落显白色，而未插入重组子的菌落显蓝色。 插入失活蓝白斑筛选技术 第一百一十一页，共一百四十一页。 原位杂交 第一百一十二页，共一百四十一页。 Southern印迹 第一百一十三页，共一百四十一页。 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 第一百一十四页，共一百四十一页。 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结 分 分离