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310 型 DNA 测序仪的测序原理和操作规程 ABI 310 型 DNA 测序仪的测序原理和操作规程 DNA 序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括 Sanger 双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert 化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 DNA 序列分析的主流。 美国 PE ABI 公司已生产出 373 型、 377 型、 310 型、 3700 和 3100 型等 DNA 测序 仪，其中 310 型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是 ABI PRISM 310 型 DNA 测序仪的测序原理和操作规程。 【原理】 ABI PRISM 310 型基因分析仪(即DNA 测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰 胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的 ddNTP(标记终止物法)，因此 通过单引物 PCR 测序反应，生成的 PCR 产物则是相差 1 个碱基的 3末端为 4 种 不同荧光染料的单链 DNA 混合物，使得四种荧光染料的测序 PCR 产物可在一根毛细 管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于 分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时， 激光检测器窗口中的 CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子 逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧 光，并在 CCD 摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为 DNA 序列，从 而达到 DNA 测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺 序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定 DNA 片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。 PE 公司还提供凝胶高分子聚合 物，包括 DNA 测序胶(POP 6)和 GeneScan 胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避 免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、 Macintosh 电 脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软 件。它使用最新的 CCD 摄影机检测器，使 DNA 测序缩短至 2.5h，PCR 片段大小分析 和定量分析为 10,40min。 由于该仪器具有 DNA 测序， PCR 片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行 DNA 测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段 PCR、RT-PCR(定量 PCR)等分析，临床上可除进行常规 DNA 测序外，还可进行单核 苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、 HLA 配型、法医学上的亲子和个体鉴定、 微生物与病毒的分型与鉴定等。 【试剂与器材】 1(BigDye 测序反应试剂盒 主要试剂是 BigDye Mix，内含 PE 专利四色荧光标 记的 ddNTP 和普通 dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2(pGEM-3Zf (+) 双链 DNA 对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3(M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即 3.2pmol/μl，试剂盒 配套试剂。 4(DNA 测序模板 可以是 PCR 产物、单链 DNA 和质粒 DNA 等。模板浓度应调整在 PCR 反应时取量 1μl 为宜。本实验测定的质粒 DNA，浓度为 0.2g/L，即 200ng/μl。 5(引物 需根据所要测定的 DNA 片段设计正向或反向引物，配制成 3.2μmol/L，即 3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如 M13(-21)引物， T7 引物等。 6(灭菌去离子水或三蒸水。 7(0.2ml 或和 0.5ml 的 PCR 管 盖体分离， PE 公司产品。 8(3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取 40.8g NaAc?3H2O 溶于 70ml 蒸馏水中，冰醋酸 调 pH 至 5.2，定容至 100ml，高压灭菌后分装。 9(70%乙醇和无水乙醇。 10(NaAc/乙醇混合液 取 37.5ml 无水乙醇和 2.5ml 3mol/L NaAc 混匀，室温可 保存 1 年。 11(POP 6 测序胶 ABI 产品。 12(模板抑制试剂(TSR) ABI 产品。 13(10×电泳缓冲液 ABI 产品。 14(ABI PRISM 310 型全自动 DNA 测序仪。 15(2400 型或 9600 型 PCR 仪。 16(台式冷冻高速离心机。 17(台式高速离心机或袖珍离心机。 【操作步骤】 1(PCR 测序反应 (1) 取 0.2ml 的 PCR