第五章固相析出分离法.pptVIP

1．金属离子沉淀： Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等； 2．生成有机酸类复合盐沉淀 （1）丹宁即鞣酸 （2）雷凡诺 （3）三氯乙酸（TCA） 第三十一页，共五十七页。 第三十二页，共五十七页。 第三十三页，共五十七页。 三、亲和沉淀 利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。 中性可溶，酸性沉淀。 第三十四页，共五十七页。 第三十五页，共五十七页。 四、高分子聚合物沉淀 水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。 五、表面活性剂 十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB） 十六烷基氯化吡啶（CPC） 酸性多糖 第三十六页，共五十七页。 第三十七页，共五十七页。 六、选择性变性沉淀法 ? 热变性沉淀法 ? 酸碱变性沉淀法 ? 利用试剂（氯仿） 第三十八页，共五十七页。 固相析出分离法 ? 第一节 盐析法 ? 第二节 有机溶剂沉淀 ? 第三节 其它沉淀方法 一、等电点沉淀法 二、成盐沉淀法 第三十九页，共五十七页。 第四节 结晶(crystallization) ? 定义：溶液中的溶质在一定条件下因分 子有规则的排列而结合成晶体。 ? 通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在 母液中，经过滤、洗涤可得到纯度高的 晶体。 第四十页，共五十七页。 ? 通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。 ? 盐析法 ? 有机溶剂沉淀法 ? 等电点沉淀法 ? 结晶法 第一页，共五十七页。 第一节 盐析法(salt precipitation) 定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 优点：简单、经济、较少变性 缺点：分辨率不高，要除盐 第二页，共五十七页。 两种现象： 盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大 盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小 第三页，共五十七页。 一、基本原理 第四页，共五十七页。 原 理 ? 形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。 ? 中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。 第五页，共五十七页。 在盐析区，符合公式 logS=β-Ksμ S——蛋白质溶解度，g/L； μ—盐离子强度, Ci——i离子浓度，mol/L； Zi——i离子化合价； β——常数,为纵坐标上的截距; Ks——盐析常数。 第六页，共五十七页。 β、KS ? β为纵坐标上的截距，是外推截距，与无机盐种类无关。 ? KS是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关。 ? 两种类型： （1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作KS盐析法。 （2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。 第七页，共五十七页。 二、影响盐析的因素 （一）、无机盐的种类 盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。 PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I― NH4+＞K+＞Na+＞Li+ 盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵 第八页，共五十七页。 (二）溶质（蛋白质等）种类的影响 第九页，共五十七页。 盐析分布曲线 第十页，共五十七页。 （三）蛋白质浓度的影响 ? 蛋白质浓度提高，盐用量减少 第十一页，共五十七页。 （四）温度的影响 ? 温度的变化会影响β值。 ? 在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反。 第十二页，共五十七页。 （五）pH的影响 ? 当溶液的pH在蛋白质等电点附近时，β值最小。 ? 利用β值最低点时pH的不同，可以分级沉淀蛋白质. 第十三页，共五十七页。 三、盐析操作 （一）盐析用盐的浓度表示 固体粉末 硫酸铵饱和溶液 常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中的最 终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度为 4.1 mol／L，定义它为100%饱和度. 第十四页，共五十七页。 第十五页，共五十七页。 （二）盐析方法和注意事项 1、分部盐析法 2、重复盐析法 3、反抽提法 一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量 的杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度 盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。 第十六页，共五十七页