多克隆抗体的制备.ppt

①研磨法 本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。 注意事项： ⑴每加一滴应研磨至小滴消失，滴加速度要慢 ⑵边加边往同一方向研磨，否则不易制成乳白色粘稠的油包水乳剂，免疫效果就差。 第23页，共38页，编辑于2022年，星期日 免疫乳剂的制备 ②注射器法： 取1.2ml佐剂+1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，用两个注射器用皮管对接，使佐剂和抗原往返推拉，直至乳化完全。 适用于制备少量的抗原乳剂。 本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少。 第24页，共38页，编辑于2022年，星期日 免疫乳剂制备成功的判别标准 油包水状态 鉴定方法是将乳化剂滴入4℃左右冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。  第25页，共38页，编辑于2022年，星期日 免疫 将制成的乳剂吸入注射器，在兔子背部及颈部皮下注射8-10点，每点约0.2ml 每隔14天用初次用量的2/5的抗原于不完全抗原中，在皮下多点注射加强免疫,每点0.2ml,共加强2次。 第二次加强免疫开始,在免疫后第7天用免疫双扩散法检查抗体效价。 第26页，共38页，编辑于2022年，星期日 思考题 佐剂的种类有哪些？ 佐剂的作用原理是什么？有何用途 弗氏佐剂中弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂有何区别？ 抗原的免疫原性与哪些因素有关？ 第27页，共38页，编辑于2022年，星期日 关于多克隆抗体的制备 第1页，共38页，编辑于2022年，星期日 一、实验目的 掌握多抗制备的原理和过程 熟悉常用的佐剂 掌握福氏完全佐剂的作用机理和制备方法 掌握研磨法和注射器法制备免疫乳剂，掌握制备成功的判别标准 掌握动物的免疫方法 第2页，共38页，编辑于2022年，星期日 二、实验原理 抗体：介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。 单克隆抗体：抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇激活具有相应抗原受体的B细胞产生的针对这一抗原决定簇的抗体，称为··· 第3页，共38页，编辑于2022年，星期日 天然抗原分子中常含有多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生的抗体中含有针对多种不同抗原表位的免疫球蛋白，称为多克隆抗体。 多克隆抗体 第4页，共38页，编辑于2022年，星期日 多克隆抗体制备的意义 免疫血清：将抗原注入机体所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，含有这种特异性抗体的血清。 免疫血清作用：对传染病的诊断、预防和治疗有重要意义，而且对器官移植，肿瘤以及某些科研工作也有重要意义。 第5页，共38页，编辑于2022年，星期日 多克隆抗体优缺点： 优点 ：作用全面，具有中和抗原，免疫调理，介导补体介导的细胞毒作用，ADCC等作用，来源广泛，制备容易。 缺点：特异性不高，易发生交叉反应，从而应用受限。 第6页，共38页，编辑于2022年，星期日 三、实验试剂与材料 动物：健康家兔 抗原：生化大实验中制备的LDL 佐剂：弗氏佐剂 注射器、研钵 等 第7页，共38页，编辑于2022年，星期日 动物的选择 动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关 如要获得大剂量的抗体，则采用大动物； 如要获得直接标记诊断用的抗体，则直接采用本动物； 如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体 第8页，共38页，编辑于2022年，星期日 动物的选择 如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，免疫时应同时选用数只动物进行免疫 一般实验室采用的抗体，多用兔子和羊； 第9页，共38页，编辑于2022年，星期日 抗原 就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等. 根据物理性状可分为颗粒型抗原和可溶性抗原。 就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。 为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原 第10页，共38页，编辑于2022年，星期日 不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等 本次实验采用抗原是生科大实验制备的LDL（至少有2mg，如量不够则用牛血清白蛋白），用生理盐水溶解。 第11页，共38页，编辑于2022年，星期日 抗原剂量的选择 抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类，免疫次数，注射途径，以及受体动物的种类，免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。 剂量过低，不能形成足够强的免疫刺激 剂量过高，有可能造成耐受 在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。 第12页，共38页，编辑于202