多克隆抗体的制备 (2).ppt

关于多克隆抗体的制备 (2) 第1页，共38页，编辑于2022年，星期日 主要内容 多克隆抗体制备的基本原理 多克隆抗体制备的操作步骤 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断 第2页，共38页，编辑于2022年，星期日 原 理 1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中，如无发生突变其基因是完全相同的。 2、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。 3、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。 第3页，共38页，编辑于2022年，星期日 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。 抗体发展历史 第4页，共38页，编辑于2022年，星期日 多克隆抗体制备流程 免疫原的制备 免疫动物 免疫血清的收集 免疫血清的鉴定 免疫血清的保存 第5页，共38页，编辑于2022年，星期日 免疫原（immunogen）： 指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）. 免疫原种类： 天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。 免疫原的制备 第6页，共38页，编辑于2022年，星期日 细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）。 可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。 第7页，共38页，编辑于2022年，星期日 细胞破碎 反复冻融法 超声破碎法 自溶法 酶处理法 表面活性剂处理法 第8页，共38页，编辑于2022年，星期日 超速离心分离： 是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密 度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只 适宜少数大分子物质的分离。 选择性沉淀： 选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如： 核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白； 8%～12%PEG6000可沉淀IgG。 粗分离 第9页，共38页，编辑于2022年，星期日 超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。 电泳 第10页，共38页，编辑于2022年，星期日 精分离 层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析 第11页，共38页，编辑于2022年，星期日 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。 蛋白含量—凯氏定氮（紫外光280nm等），Lowry 分子质量—电泳、质谱 蛋白纯度—电泳、HPLC 免疫原性—免疫印迹 、免疫双扩散、免疫组化 蛋白活性— ELISA、XTT 蛋白结构—红外光谱、氨基酸测序 蛋白等电点—IEF 蛋白鉴定 第12页，共38页，编辑于2022年，星期日 免疫佐剂 某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。 第13页，共38页，编辑于2022年，星期日 佐剂的种类 佐剂一般包括以下几类： 无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等； 生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等； 人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等； 纳米佐剂 第14页，共38页，编辑于2022年，星期日 弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）