生化与分子生物学研究思路与技术.pptx

生化与分子生物学研究思路与技术一、生物化学研究的目的:从分子水平了解活细胞相关的所有化学进程。对健康、营养的理解和维持以及对疾病的发生机理的阐明和有效治疗。 二、生物化学的研究对象:研究生物分子的组成成分如碳、氢、氧、氮、磷等化学元素以及水和无机盐代谢。研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、多糖及脂类的结构、功能、结构与功能的关系以及这些生物大分子的代谢和相互作用。三、生物化学研究的发展: 生物化学研究历经两百多年进入分子生物学年代,走过了三个发展时期: 叙述生物化学时期 动态生物化学时期 功能或分子生物化学时期 叙述生物化学(descriptivebiochemistry)时期(1770～1903) 又称为静态或形态生物化学(static or morphological biochemistry)。研究生物体内主要化学物质的组成;分离出各种氨基酸、脂酸、甘油、糖类、柠檬酸、乳酸和苹果酸;从肝中分离出糖元;发现了核质(nuclein)及核酸;奠定了酶学基础理论。此时期中国人民的贡献:我国人民在公元前二十一世纪,已用曲酿酒,称曲为酒母,又叫做酶;公元前十二世纪,已将豆、谷发酵,捣烂、加盐以造酱,并制出麦芽糖,当时称为 “饴”。公元九世纪或十世纪已制成豆浆和豆腐。2、 动态生物化学(dynamic biochemistry)时期(1903～1950) 又称为生理化学(physiological chemistry)。主要研究生物体内组成物质的化学变化。分离制备结晶酶;阐明细胞氧化和呼吸链及维生素和激素化学性质与生理作用;建立了有关发酵和三羧酸循环、脂酸的β－氧化作用以及肝中尿素合成的完整生化途径等。此时期中国人民的贡献:我国生物化学家建立了血滤液制备与血糖测定的生化方法;提出了蛋白质变性学说;首先使用定量分析技术研究抗原抗体反应的机理。3、 功能或分子生物化学(functional or molecular biochemistry)时期 (1950年至今) 从分子水平探究蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功能的相关和它们的相互作用,包括蛋白质和核酸的提纯及其化学组成、氨基酸或核苷酸的一级结构序列以及空间构型、构象的确定;建立DNA双螺旋模型;人工合成肽激素、tRNA和核酶;建立分子克隆技术和遗传工程技术等。 此时期中国人民的贡献:我国生化工作者于1965年首先成功合成了有生物活性的牛胰岛素;1972年借助X-射线衍射技术研究了猪胰岛素分子的晶体结构;1981年首次合成具生物活性的酵母丙氨酸tRNA;九十年代,成功制备重组Ⅷ因子和促红细胞生成素(EPO);参与完成人类基因组计划。四、生化研究的基本思路 和技术路线:经典的生物化学研究包括三个主要步骤: 分离细胞器和生物分子。 判断生物分子的结构。 分析生物分子的功能和代谢(合成与 分解)及其相互作用。1 、细胞器和生物分子的分离:细胞器是一种独立亚细胞单位。一般采纳匀浆及离心等进行亚细胞分离。分离后还必须采纳测量“标志”酶及特别化学成分或电子显微镜观察的方法来评估各亚细胞组分。 要了解生物分子的结构,首先必须得到纯化的生物分子。用于分离和纯化生物分子的方法特别多,例如盐析法、层析法、凝胶过滤、电泳、超速离心等。要得到均一性的生物分子往往需要综合性采纳多种方法。细胞器的标志性成分和主要功能 亚细胞器/单位 标志物 主要功能细胞核线粒体核糖体内质网溶酶体胞膜高尔基复合体过氧化物酶体细胞骨架细胞质DNA谷氨酸脱氢酶高丰度的RNA葡萄糖-6-磷酸酶酸性磷酸酶Na+-K+-ATP酶,5′-核苷酸酶半乳糖基转移酶过氧化氢酶,尿酸氧化酶没有特征性酶乳酸脱氢酶组成染色体,携带遗传信息。以自身为模板指导合成RNA(转录)。三羧酸循环,氧化磷酸化。蛋白质合成位点(以mRNA为模板翻译成蛋白质)。合成多种脂类,氧化外源性生物分子(细胞色素P450)。含有众多水解酶(酶促降解反应)。转运物质进出细胞,细胞粘附和联系。细胞内的蛋白质分类,糖基化作用,硫化反应。降解部分脂肪酸和氨基酸,产生和分解过氧化氢。微丝、微管、中间纤丝。糖酵解酶类,脂肪酸合成酶。2 、生物分子的结构确定 :质谱和核磁共振。某些已知特性的酶。X-射线衍射和晶体学方法。3 、生物分子的功能和代谢分析:1)生物分子的功能分析 人类和动物的研究最初是从动物整体水平开始的,例如对呼吸和消化的研究。将许多整体动物水平的复杂现象转移到体外研究则简单得多。不同层次研究生物分子功能的方法 策略 方法动物整体水平研究去除一个器官(例如切除肝脏)。改变能量来源(例如禁食)。给予药物(例如苯巴比妥)。给予有毒药物(例如四氯化碳)。利用有特定疾病的动物(例如糖尿病)。离体器官灌注肝脏、心脏、肾脏灌注。灌注能够维持离体器官的功能达数小时,能够不