冷冻切片方法及注意事项参考.pdf

一、实验前准备 清理实验台及仪器。 开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（ - 15~-20 ℃* ）。 准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。 二、取材 解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（ 24 ×24 ×2mm* ）,以 防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡 ,使细胞内结构移位。 （注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性， 应避免不必要的脂肪及坏死组织附着 ;要尽 量剔除毛发、 硬骨或钙化物 ;保乳手术切缘由于脂肪组织较多 ,取材厚度最好不要超过 3mm，厚者冰冻费 时，大者难以切完整。甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。 ） 三、冷冻切片 1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织， 至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（ 1~3 分种）。 2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切， 一般在 5～10 μm 间。 4 、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调 较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时 顺着一个方向稍微用力轻轻一带 ,可避免组织摊片过程中皱折 ,保证组织结构的完整及切片的美观。 注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会 影响标本冷冻质量。 常用的有三种包埋剂 OCT 剂、B 超藕合剂以及普通胶水。 B 超藕合剂适用于细胞丰 富质地较嫩的组织 ,普通胶水或 OCT 剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。 （OCT 包埋剂骤冷时固化，其冷 冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。 ） ②组织块过小： 先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻 ,约 30 秒钟左右待胶凝固时将小组织放上 , 组织周围再加一些胶 ,再次置于冷冻机中冷冻 ,这样组织被垫高 ,就能快速切出高质量的切片。 ③冷冻箱及冷冻头的温度高低，要根据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬 ,切片碎裂 , 出现梯 田状薄厚不均或空洞 ;反之 ,温度过高 ,组织块硬度不够 ,切片不易成形或成皱褶。数据图 1 供参考。 ④当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片， 或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 ⑤用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的 载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质 间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固 地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。 四、常用冰冻切片苏木精 —伊红染色 染色步骤： 1、冰冻切片用 10%甲醛固定 1~5 分钟，流水冲洗 2 分钟，蒸馏水浸洗 3 分钟。 2、苏木精 1~2 分钟。自来水快洗。 3、0.5%盐酸乙醇分色 1~2 秒。蒸馏水快洗。 4、0.25%~0.5%氨水蓝化，几秒种或至组织变蓝，自来水洗 30 秒 ~1 分钟。光镜下检查细胞核分色程度。 5、1%伊红 1 分钟。蒸馏水快洗。 6、80%、90%、95%乙醇速洗，每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比。 7、100%乙醇 2 次，每次 1~2 分钟。 8、二甲苯 2 次，每次 1~2 分钟。中性树胶封固。 注：①结束阶段的二甲苯作用为透明，其目的