薄层色谱操作方法 .docxVIP

PAGE PAGE 1 薄层色谱操作方法 1．薄层板制备可以购买商品的预制板(有一般薄层板及高效薄层板)，也可以自行制备。制备办法是：将玻璃板裁成正方形或长方形，分析用为20cm×20cm和10cm×20cm；预试用为3cm×10cm和2.6cm×7.6cm(显微镜用载玻片)。将玻璃片洗净烘干。铺层办法有干法和湿法两种，现常用湿法，由于它具有薄层牢固、可批量制备、绽开后便于保存、分别效果好等优点。选用粒径为0.048～0.058mm (250～300目)的硅胶，加入(CMC)或锻石膏(CaSO4·1/2H2O)为黏合剂(市售硅胶G是已加了12％～14％煅石膏的硅胶)，加入约3倍体积的水，调成糊状，倾倒在玻璃板上，轻轻颠动玻璃板，调好的硅胶自动淌成匀称薄层。也可用涂铺器铺层。按照用途薄层厚度可不同，普通分析用约为0.25mm，制备用约为1～3mm。涂铺好的薄层板在室温晾干后，按照活性要求在一定温度下加热活化后存于干燥器中备用。市售的薄层用硅胶标有硅胶GF254和硅胶GF365，即为加有1.5%～2％荧光剂的荧光薄层板，用于在紫外光254nm或365nm照耀定位用。在紫外光照耀下，薄层板显荧光，样品斑点处不显荧光。2．点样样品制成溶液(溶剂最好挑选与绽开剂极性相像且易于挥发的有机溶剂)，浓度约0.5～2mg/mL。点样量为0.5～5 uL，在距底边1cm处点样，原点直径在3～4mm。手工点样用毛细管或微量注射器，如用点样仪点样，样量精确，外形整齐全都，能提高定量分析的精确?????度。点样量与薄层性能、厚度及显色敏捷度有关，按照需要来详细确定。点样量太小，斑点不能显示，点样量太大，影响比移值和斑点外形。3．绽开首先是挑选绽开剂，合适的分别体系是分别胜利的关键，挑选原则与经典柱色谱相同。合适的绽开剂使组分绽开后斑点清楚、集中、不拖尾，待测组分的Rf值最好为0.4～0.5。如待测组分较多，Rf值也可在0.25～0.75。可借鉴手册和文献及绽开剂挑选最佳化办法通过试验挑选。绽开的试验操作是将点样后的薄层板置于密闭的层析槽中，下端浸入绽开剂高度不应超过0.5cm。绽开距离普通为10～15cm。按照溶剂移动的方向分为上行绽开和下行绽开。图8-18(a)是一种近水平上行绽开槽。图8-18(b)是一种双底槽绽开槽，节约溶剂且可便利地在另一底层中放绽开剂或其它试剂，其蒸气可预饱和薄层板。图8-18薄层绽开槽另外，还可利用多次绽开、双向绽开等办法得到不同的层析结果。4．定位与显色确定被分别组分的位置称为定位。绽开后的薄层板自槽中取出，室温下挥发去溶剂。若被分别组分本身有色彩，它们的位置按照有色的斑点即可确定。无色的化合物可采纳物理检出法、化学检出法、酶与生物检出法和发射检出法来定位。(1)物理检出法物理检出法属于非破坏性检出法。常用的有：①紫外光有的化合物能汲取紫外光同时发出更长波长的光即荧光，可用此荧光定位。另一种办法是荧光消除技术，用有荧光剂的薄层板举行绽开，于254nm或365nm荧光灯下观看，在波长230～390nm有汲取的化合物，在绿色的荧光背景上显暗紫色斑点。如化合物的紫外汲取较弱则检出不敏捷。②碘多数有机化合物能吸附碘，使斑点呈淡黄色或褐色。此反应普通可逆，碘挥发后，组分又回到本来的状态。此法可在密闭容器中放几粒碘晶体或喷雾0.5％碘的溶液。③水憎水化合物在硅胶薄层绽开后，可用水喷雾，对光观看，显示白色不透亮?????的斑点。(2)化学检出法化学检出法是用法一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成有色化合物而定位。这种试剂叫显色剂。显色剂分为通用显色剂和专属性显色剂，表8-9列出部分通用显色剂，显色方式有喷雾法和浸渍法(必需硬板)。表8-9部分通用显色剂5．定性①与已知的标准品在同一块薄层板上举行对比，若Rf值相同，可能为同一化合物。还需用几个薄层层析系统比较，组分与标准品的Rf值均全都，普通可认为是同一化合物。②试样斑点与标准品的显色特性相同可协助鉴定。③斑点用光密度计原位扫描，得到汲取光谱或荧光光谱可用于定性。④收集斑点，洗脱组分，用紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振等办法鉴定。6．定量样品组分经薄层分别后，可用以下两种办法定量：①洗脱法把组分斑点位置的吸附剂取出，用溶剂洗脱后，用其它办法(如分光光度法、荧光等办法)测定。此法操作复杂，效率较低。②原位法即在薄层上组分斑点位置举行测定。又可分为目测法、测面积法和薄层扫描仪扫描定量法。目测法即是用肉眼观看斑点的大小和色彩的深浅，与一系列不同浓度的标准品斑点相比较。此法可用于粗略定量和限界分析。用测面仪可画下斑点面积举行定量分析。这两种办法都是较粗略的定量办法。薄层扫描定量法是采纳仪器办法，挺直测定薄