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液相色谱注意事项及处理液相色谱仪原理及构成液相色谱仪的储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，因此在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。高效液相色谱仪(HPLC)是由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳;进样系统要求进样便利切换严密;由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。液相色谱仪的工作流程固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。用来分离被测组分的物质，目的是把样品里面的成分留下，固定住；流动相：载体，与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。是将物质带到固定相里并通过固定相的流体，在气相里就是载气，在液相里就是液体。泵：由于色谱柱很细，填充剂粒度小，因此阻力很大，为达到快速、高效分离，必须有很高的柱前压力，以获得高速的液流。色谱柱：分离开待测组分和其他干扰组分，有利于分别定性、定量进样器：是在色谱系统中，能定量地将分析试样送入色谱柱的装置。其原理是计量泵定量将样品吸入定量环，通过一个切换阀转入高压流路，另外一个切换阀连接清洗溶液和清洗口，根据设置完成对计量泵内的清洗，清洗口是用来清洗针头，进样口连接高压阀，液相进样器的针头插在进样口处，为防止样品交叉污染，通常针头和进样口保持最小的接触面积（不是插入），同时两个斜面通过弹簧力压紧密封，防止高压流路在此处流出。检测器：将色谱柱分离的化学物质作为信号源并将其转化为电压信号或电流信号，并将信号放大输出，以便记录，再通过工作站或处理机或手工处理得出分析数据。数据系统：将检测器得出的分析数据记录保存下来。液相色谱仪注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3.正常情况下，仪器首先用甲醇或柱洗液冲洗10-20分钟，然后再用流动相冲洗20-30分钟，仪器方可稳定，最重要的是仪器基线走后，方可进样测试。4.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉6.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。7.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：?高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75?Kg/cm2以上。?高速-流速为0.1~10.0?ml/min。?高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。?高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。?HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：?速度快-通常分析一个样品在15~30?min，有些样品甚至在5?min内即可完成。?分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。?灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。?柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。?样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。液相色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 1、正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 2、反相色谱法一般用非极性固定相（如C