实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx

及时荧光定量PCR详细实验步骤 及时荧光定量PCR详细实验步骤 及时荧光定量PCR详细实验步骤 以下实验步骤仅供参照： 样品 RNA的抽提 ① 取冻存已裂解的细胞，室温搁置 5 分钟使其完整溶解。 ② 两相分别每 1ml 的 TRIZOL试剂裂解的样品中加入 0."2ml 的氯仿，盖紧管盖。 手动强烈振荡管体 15 秒后， 15 到 30℃ 孵育 2 到 3 分钟。 4℃ 下 12000rpm 离心 15 分钟。离心后混淆液体将分为基层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。 RNA所有被分派于水相中。水相上层的体积大概是匀浆时加入的TRIZOL试剂的 60%。 RNA 积淀将水相上层转移到一洁净无 RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混淆以积淀此中的 RNA，混匀后 15 到 30℃孵育 10 分钟后，于 4℃下 12000rpm 离心 10 分钟。此时离心前不行见的 RNA积淀将在管底部和侧壁上形成胶状积淀块。 ④ RNA 冲洗移去上清液，每 1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入起码 1ml 的 75%乙醇（ 75%乙醇用 DEPCH 2O 配制），冲洗 RNA积淀。混匀后， 4℃下 7000rpm 离心 5 分钟。 ⑤ RNA 干燥当心吸去大多数乙醇溶液，使 RNA积淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。 ⑥ 溶解 RNA积淀溶解 RNA 时，先加入无 RNA酶的水 40μl用枪频频吹打几次，使其完整溶解，获取的 RNA溶液保留于 -80℃待用。 RNA质量检测 1）紫外汲取法测定 1 / 9 先用稀释用的 TE溶液将分光光度计调零。而后取少许 RNA溶液用 TE稀释 （1:100）后，读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的汲取值，测定 RNA溶 液浓度和纯度。 ① 浓度测定 A260 下读值为 1 表示 40 μ g RNA/ml。样品 RNA浓度 ( μ g/ml)计算公式为： A260×稀释倍数 × 40 μ g/ml。详细计算以下： RNA 溶于 40 μ l DEPC水中，取 5ul，1:100 稀释至 495μl的 TE中，测得 A260= 0."21 RNA 浓度 = 0."21 × 100 × 40 μ g/ml = 840或 μ g/ml 0."84 μ g/ μ l 取 5ul 用来丈量此后，节余样品 RNA为 35 μl，节余 RNA总量为： 35 μ l × 0."84 μ g/ μ l = 29."4 μ g ② 纯度检测 RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA纯度，比值范围 1."8 到 2."1 。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ① 制胶 2 / 9 1g 琼脂糖溶于 72ml 水中，冷却至 60℃，10 ml 的 10× MOPS电泳缓冲液和 18ml 的 37%甲醛溶液 ( 12."3 M) 。 10× MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7."0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔起码能够加入 25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的 1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 ② 准备 RNA样品 取 3μgRNA，加 3 倍体积的甲醛上样染液，加 EB于甲醛上样染液中至终浓度为 10μg/ml。加热至 70℃孵育 15 分钟使样品变性。 ③ 电泳 上样前凝胶须预电泳 5min，随后将样品加入上样孔。 5–6V/cm 电压下 2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶起码 2–3cm。 ④ 紫外透射光下察看并摄影 28S 和 18S核糖体 RNA的带特别亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA的物种种类），上边一条带的密度大概是下边一条带的 2 倍。还有可能察看到一个 更小略微扩散的带，它由低分子量的 RNA（tRNA 和 5S核糖体 RNA）构成。在18S和 28S核糖体带之间能够看到一片弥散的 EB染色物质，可能是由 mRNA和其余异型 RNA构成。 RNA制备过程中假如出现 DNA 污染，将会在 28S核糖体 3 / 9 RNA带的上边出现，即更高分子量的弥散迁徙物质或许带， RNA的降解表现为核糖体 RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 3 样品 cDNA 合成 ① 反响系统 序号反响物剂量 1 逆转录 buffer2μl 上游引物 0."2 μl 下游引物 0."2 μl dNTP 0."1 μl 逆转录酶 MMLV 0."5 μl DEPC水 5μl RNA模版 2μl 整体积 10μl 轻弹管底将溶液混淆， 6000rpm 短暂离心。 ② 混淆液在加入逆转录酶 MMLV 以前先 70℃干浴 3 分钟，拿出后立刻冰水浴至管内外温度一致，而后加逆转录酶 0."5 μl，3