分子杂交技术.docx

分子杂交技术 分子杂交技术 互补的核音酸序列通过 Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子 DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特 异性的 , 可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。 该检测对象可以是克隆化的基因组 DNA也可以是细胞总DNAg；总RNA根据 使用的方法被检测的核酸可以是提纯的， 也可以在细胞内杂交 , 即细胞原位杂交。 探针必须经过标记，以便示踪和检测。 使 用最普遍的探针标记物是同位素 , 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性 , 因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶 切图谱的制作、 基因组中特定基因序列的定性、 定量检测和疾病的诊断等方面。 因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地 应用 , 而且在临床诊断上的应用也日趋增多。 第一节 核酸探针标记的方法 核酸探针根据核酸的性质，可分为DN所口 RNAf针；根据是否使用放射性标记物的与否 ，可分为放射性标记探针和非放射 性标记探针 ; 根据是否存在互补链 , 可分为单链和双链探针 ; 根据放射性标记物掺入情况 , 可分为均匀标记和末端标记探针。 下 面将介绍各种类型的探针及标记方法。 一、双链DN琳针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链 DNAf针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。 双链DNAf针的合成方法主要有下列两种 ：切口平移法和随机引物合成法。 1.切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时，DNA聚合酶I就可将核昔酸连接到切口的 3羟基末端。同时该酶具有从5-3的核酸外切酶活性，能从切口的5端除去核昔酸。由于在切去核昔酸的同时又在切口的 3端补上核昔酸，从而使切口沿着 DNA1移动，用放射性核昔酸代替原先无放射性的核昔酸， 将放射性同位素掺入到合成新链 中。最合适的切口平移片段一般为 50-500个核昔酸。切口平移反应受几种因素的影响 ：(a) 产物的比活性取决于[a -32 P]dNTP的比活性和模板中核昔酸被置换的程度。 (b) DNA酶I的用量和DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。 (c) DNA 模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性 , 故应使用仔细纯化后的 DNA。 材料： 待标记的 DNA。 设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。 试剂： (1)10 X切口平移缓冲液：L Tris - Cl ; L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100 gg/ml BSA。 (2)未标记的dNTP原?^ :除同位素标记的脱氧三磷酸核昔酸外 ，其余3种分别溶解于50mmol/L Tris - Cl溶液中，浓度为 L。 (3)[ a -32 P] dCTP 或[a -32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10 g Ci/ g l o DNA 聚合酶 I (4 单位/ r l):溶于 50g g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 5 0咐油，50mmol/L Tris - Cl 中。 (5)DNA 酶 I :1mg/ml。 (6)EDTA :200mmol/L 。 (7)10mol/L NH4Ac 。 操作步骤 : 按下列配比混合 : 未标记的dNTP 1Og l 10X切口平移缓冲液 5 M l 待标记的DNAmg [a -32 P]dCTP 或 dATP(70g Ci) 7 屋 DNA聚合酶4单位 DANS I 1 ill 加水至终体积 50 M l 置于 15℃水浴 60 分钟。 (3)加入5 M l EDTA终止反应。 (4)反应液中加入醋酸镂，使终浓度为L,加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收 DN碾针。 [注意]1、3H, 32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[a -32 P]-dNTP。 2、DNA酶I的活性不同，所得到的探针比活性也不同， DNAgl活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。 2.随机引物合成法 随机引物合成双链探针是使寡核昔酸引物与 DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNAf针。 合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、 dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核昔酸。利用 随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5-3外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模 板的要求不严格，用微量制备的质粒 DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高，可达4X 109 cpm/^g探针。(4)随 机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。 材料：待标记的DNAt段。 设备：高速台式离心