分子生物学chapter研究法new.pptxVIP

分子生物学 ;从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 ;基因工程技术是核酸操作技术的一??分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。 ;DNA操作技术 基因克隆的常用载体系统 基因的分离与鉴定 ;5. 1 重组DNA技术发展史上的重大事件 三大成就： 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。;重组DNA技术史上的主要事件 ;1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。 1981 Palmiter和Brinster获得转基因小鼠，Spradling和Rubin得到转基因果蝇。 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物——胰岛素，Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。;1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1986 GMO(genetically modified organism)首次在环境中释放。 1988 Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。 1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠—“Oncomouse”。 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)。 1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。;1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 2000 完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定（(1.15×108bp)。 2001完成第一个人类基因组全序列测定(2.7×109bp)。;限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。;;;仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。;具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。 获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。 ;;表5-2 重组DNA实验中常见的主要工具酶 ;5. 2 DNA操作技术 ;基本原理 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。 ;生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。;琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 ;表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 ;在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量，也可以被清晰地检测出来。 ;;;5. 2. 2 核酸的分子杂交 ;经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用按其在凝