《临床微生物检验》嗜血杆菌属.ppt

微生物学检验 临床标本： 痰、气管分泌物、胸水和血液为主。 病理组织标本： 必须制成悬液，再进行涂片和分离培养。 环境标本： 应先浓缩再接种。 标本处理 标本来源：临床标本(sputum),环境标本(water、soil) 标本处理：以环境水为例 a.浓缩(concentrate):用0.45um的滤膜 b.洗脱(elute):加1.5ml无菌水，振荡1分钟 c.酸化(acid treatment):加1.5ml的0.2M KCL-HCL (PH2.2),室温放置4分钟。 d.稀释(dilute):0.1ml标本＋2.4生理盐水 e.接种(plate):取100ul标本螺旋接种在MWY平板上(常 用培养基有BCYE、MWY、GVPB等) f.培养(culture):普通培养箱36℃孵育7－10天。 g.计算菌落数 微生学物检验 分离培养与鉴定： 营养要求苛刻，生长缓慢 生长温度为35℃ 最适pH6.7~7.0 初次分离必须采用(BCYE) 3~10天可形成1~2mm直径的光泽菌落 色素产生 分别选取一个菌落转种 根据菌落形状分组，记录菌落特征 *选取只在BCYE平板上生长的菌落做 BCYE 琼脂 Blood 琼脂 血清学分型 检测抗体 核酸检测（PCR检测特异基因） 直接镜检 生化鉴定（P154） BCYE琼脂 血清学分型 玻片凝集法(检测O抗原) 常用血清抗体： 1> L.pneumophila(subgroup 1-6) 2> L.micdadei 3> L.bozemanii 4> L.dumoffii 5> L.gormanii 抗原制备： 1)准备菌悬液－－挑取菌至含有0.5-1 ml的生理盐水(0.85 ％)的玻璃试管中，充分混匀。 2)加热－－121℃(15min)或100℃(1h) 3)浓缩－－3000-3500 rpm(15min),去上清 4)抗原液准备－－加生理盐水(0.85％)溶解 5)凝集反应－－在玻片上各滴加1滴血清和抗原液，轻摇混 匀反应，2min内观察结果。阳性可见明显 的细颗粒。 检测血清抗体（IgG 和 IgM） 1. 间接免疫荧光法(IFA)，如恢复期比急性期血清 标本滴定度上升4倍并达1：128或滴定度在1： 128以上； 2. 试管凝集实验和微量凝集实验(TAT)，两份血清 标本前后抗体滴定度上升4倍并达1：160或滴 定度在1：160以上；两份标本前后抗体滴定度 上升4倍并达1：64或滴定度在1：64以上，(微 量凝集实验)。 3. ELISA法。 免疫学检测 是快速特异的方法，采用DNA探针及PCR扩增16SrRNA的方法均可用于军团菌的快速诊断 核酸检测 普通PCR鉴定 PCR检测两种基因(16SrRNA和Mip) 1.16SrRNA是所有细胞中最保守的基因，用测序或PCR检测编码的基因可鉴定一种生物学分类。 2.Mip(macrophage infectivity potentiator)基因编码军团菌一种表面蛋白(24KD)的致病因子,便于菌侵入宿主细胞内。Mip基因是军团菌属特有的，且不同种间序列有明显区别。嗜肺军团菌主要寄生在水中原生动物和人巨噬细胞内，可用PCR检测Lp mip(L.pneumophila mip)来鉴定。 LEG 430 bp Lmip 650 bp 3 5 6-1 M 6-2 6-3 N P 3 5 6-1 M 6-2 6-3 N P 药物敏感试验 一般不做体外药敏试验，目前还没有标准的方法。 军团菌感染诊断试验 试验 敏感性(%) 特异性(%) 评注 培养鉴定 70 100 参考方法 直接免疫荧光 25～70 >95 不推荐常规应用 间接免疫荧光 70～90 >99 只用于嗜肺军团菌血清群1 酶标记免疫 70～90 >99 乳胶凝集 55～90 85～99 血清学（间接免疫荧光）