细胞的复苏、传代和冻存.ppt

学会传代细胞的复苏 学会传代细胞的培养 学会细胞的冻存 培训目的 仪器 P2实验室 二氧化碳培养箱 倒置显微镜 生物安全柜 水浴锅 液氮罐等 实验材料 pH7.2生理盐水、DMEM、胰酶、碳酸氢钠、超纯水、DMSO、新生牛血清、细胞培养瓶、滴管、冻存管、等 按常规配制含DMEM、PBS、0.25% 胰酶、100x双抗等。 将洁净的滴管、细胞瓶等包装。 将包装好的PBS、滴管、细胞瓶等高压蒸汽灭菌。 将配置好的DMEM、胰酶、双抗等过滤除菌。 一、前期准备 二、细胞的复苏 15ml离心管和细胞瓶中分别加入5-6ml 细胞培养液。 从液氮中取出冻存管，迅速于37水浴中融化。 将细胞移入15ml离心管，离心。 以1ml培养液悬浮细胞。 将细胞移入细胞瓶，置于二氧化碳培养箱中培养。 观察：次日观察细胞生长情况。 三、细胞的传代培养 洗涤：弃掉细胞瓶内的培养液，用PBS洗涤细胞3次； 消化：在细胞瓶内加入0.25%胰酶 1ml，轻摇，使其覆盖细胞表面；将细胞瓶置于37温箱中作用3min； 轻拍细胞瓶，加2mlDMEM于细胞瓶中，用滴管反复吹打细胞悬液，使细胞充分分散； 在新的细胞瓶中加入DMEM5ml，并移细胞悬液1ml于已经加有DMEM的细胞瓶，轻轻摇匀，置于37℃ 二氧化碳培养箱中培养；次日观察细胞生长状态。 四、细胞的冻存 冻存液的配制：10%DMSO+30%血清+60%DMEM，混合均匀； 细胞消化：将生长状态良好的细胞进行洗涤消化； 加入冻存液：在细胞瓶中加入2ml冻存液，轻轻吹打混匀，装入冻存管； 将冻存管置于-80℃冰箱保存； 将冻存管移入液氮罐中冻存。 分组 注意严格的无菌操作 组织须尽量剪碎 分装细胞注意细胞悬液的浓度 vero细胞 传代细胞的复苏、培养和冻存