PCR教程-研究生用.ppt

一、DNA置备 6pg/细胞 （一）理想DNA样品的要求 1.纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。 2.完整性-DNA大分子。 3.DNA量。 （二）经典DNA提取法 1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆，溶解胞、核膜。 2.去垢剂（SDS）与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。 3.有机溶剂（酚与氯仿）去除蛋白，萃取DNA。 4.乙醇与盐类沉淀DNA。 （三）试剂的使用原理 1.弱碱和螯合剂：Tris-HCl pH8.0，DNA分子稳定。 EDTA（乙二胺四乙酸）-通过螯合镁离子抑制核酸酶。 2.去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）增加膜通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶与蛋白质变性。 蛋白酶K酶解组蛋白。 3.有机溶剂：酚：变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。 氯仿：变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。 异戊醇：除酚，除泡沫。 4.乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。 （四）基本步骤 1.样品处理：分离细胞，低渗盐水（0.2%）或细胞悬浮液。（10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS）。 2.消 化：TNE缓冲液 （15mmol/L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl）4ml，10%SDS0.45 ml，10mg/ml蛋白酶K（终浓度，100μg/ml），混匀，50℃3h，45℃过夜。 3.DNA 分离：等体积饱和酚；等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）；氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min。 4.沉淀 DNA：1/10体积3mol/L NaAc，2倍无水乙醇-70%乙醇。离心，挥干。可加醋酸钠（终浓度：0.3mol/L）并低温。10-20分钟。 5.溶解DNA：适量TE（10mmol/L Tris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA）,长时间。 （五）其他方法 1.Chelex-100提取DNA 基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基苯 共聚物。 基本方法：沉淀细胞；5%试剂200μl；56℃0.5h以上；100℃8min；剧烈震荡；离心上清。注意：离心彻底。 2.硅珠法提取DNA 基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性），二氧化硅（硅珠，核酸吸附）。 基本方法：血液（1-4μl）TES（100μl）SDS（20μl）煮沸5min；300μl GuSCN溶液与20μl硅珠液保温15 min；离心后加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗；TES56℃10 min离心取上清。 3.直接煮沸法 100℃10min （六）注意事项 1.如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。 2.消化时间宜长不宜短。 3.操作轻柔。 4.混匀要充分。 5.挥干不宜过度。 （七）DNA定量 1.凝胶电泳半定量分析法：参照标准分析。 2.分光光度计分析 基本原理：260nm波长为核酸吸收峰，1OD值为50μg/μl双链核酸（40μg/μl单链核酸），根据OD值可计算DNA含量。 计算方法：DNA浓度（μg/μl）=OD×50×稀释倍数÷1000 例：40倍稀释液，OD值为1.7 DNA浓度=1.7×50×40÷1000=3.4μg/μl 280nm波长为蛋白吸收峰，260/280比检测核酸纯度。1.6-1.8 （八）DNA纯化 二、聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）：在模板DNA和4种脱氧核苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程。100万倍，由数pg-数μg。 （一）PCR的基本过程 1.变性（denaturation）:在加热的条件下（94℃左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。 2.退火/复性（annealing）：在降温的条件下（55℃-62℃），引物与其互补的模板DNA片段（靶片段的側翼序列）结合形成杂交双链。 3.延伸（extension）：在合适的温度下（68℃-72℃），经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸，由引物的3ˊ端为起始点，从5ˊ向3ˊ端延伸，合成新的与DNA 靶片段互补的DNA链。 每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍，并以指数的量堆积，经30余次循环，产物量可达到2×105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。 （二）PCR反应的体系 标准体系为50-100μl，常用20μl。 DNA模板10-50ng DNA聚合酶0.5-1.0U