引物设计原则(必看).pdf

mi 引物设计原则 1. 引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长 会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3 ’端相似性较高的序列，否 则容易导致错配。 引物 3’端出现 3 个以上的连续碱基， 如 GGG 或 CCC，也会使 错误引发机率增加。 3. 引物 3 ’端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。 不同的末位碱 基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基， 因此应当避免在引物的 3’端使用碱基 A 。另外，引物二聚体或发夹结构 也可能导致 PCR 反应失败。 5’端序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰 位点或标记物。 4. 引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游 引物的 GC 含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使复性条件最佳。 Tm 值的计 算有多种方法，如按公式 Tm ＝4(G+C) ＋2(A+T) ，在 Oligo 软件中使用的是最邻 近法 (the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的 相对稳定性。应当选用 3’端 ΔG 值较低（绝对值不超过 9 ），而 5’端和中间 ΔG 值相对较高的引物。 引物的 3’端的 ΔG 值过高， 容易在错配位点形成双链结构并 引发 DNA 聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过 高（超过 4.5kcal/mol ）易导致产生引物二聚 体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在 5 ’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成 5-3 方向的， Tm 之间的差异最好控制在 1 度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好， 500bp 左右。 要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是 否形成二级结构。 如这个区域单链能形成二级结构， 就要避开它。 如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在 15~30碱基之间。 ④ G+C 含量在 40%~60%之间。 ⑤ 碱基 要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连 续 4 个碱基的互补。 ⑧ 引物 5′端可以修饰。 ⑨ 引物 3′端不可修饰。 ⑩ 引物 3 ′端要避开密码子的第 3 位。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互 补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA 二级结 构的影响， 选择扩增片段时最好避开二级结构区域。 用有关计算机软件可以预测 估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能 （△G°