植物病毒病的诊断与鉴定精品课件.ppt

二、电子显微镜技术 与光学显微镜相比，电子显微镜使用光源的波长更短(属于短波电子流)，因此分辨率也大大提高(9.9×l 0-11m，比光学显微镜高千倍以上)。但是电子束的穿透力低，样品厚度必须在10~100nm之间。所以电镜观察需要特殊的载网和支持膜，需要复杂的制样和切片过程。 病毒观察最常用的是负染技术和免疫电镜技术。所谓负染，是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外围的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。与超薄切片(正染色)技术相比，负染不仅快速简易，而且分辨率高，目前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的观察及免疫学和细胞化学的研究工作中，尤其是病毒的快速鉴定及其结构研究所必不可少的一 项技术。 * 三、血清学技术 抗血清制备：利用植物病毒衣壳蛋白的抗原(antigen)特性，可以制备病毒特异性的抗血清(antiserum)。先将纯化的植物病毒注射小动物(兔子、小白鼠、鸡等)，一定时间后取血，获得抗血清。血清制备的关键是病毒的纯化，纯度高的病毒才能获得特异性强的抗血清。血清反应植物病毒与其血清的反应有好多种，但依据的原理都是抗原与抗体的特异性结合。最常用的两种方法是琼脂双扩散和酶联免疫吸附测定法。 * 琼脂双扩散法：在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体和抗原互相扩散，在适当的位置形成沉淀；沉淀线的形状说明抗原和抗体的相互关系。 酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)法：该方法利用了酶的放大作用，使免疫检测的灵敏度大大提高。与其它检测方法相比较，ELISA有突出的优点：一是灵敏度高，检测浓度可达1-10ng／m1;二是快速，结果可在几个小时内得到；三专化性强，重复性好；四是检测对象广，可用于粗汁液或提纯液，对完整的和降解的病毒粒体都可检测，一般不受抗原形态的影响；五是适用于处理大批样品，所用基本仪器简单，试剂价格较低,且可较长期保存。具有自动化及试剂盒的发展潜力。ELISA是实现“快速、准确、经济”检测的最好手段之一 * 四、核酸杂交及PCR技术 血清学技术利用的是病毒衣壳蛋白的抗原性，检测的目标是蛋白。由于核酸才是有侵染性的，仅仅检测到蛋白并不能肯定病毒有无生物活性。因此，核酸检测技术也是鉴定植物病毒的更可靠方法，主要有核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)方法比较常用。 核酸杂交主要在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补的DNA之间存在着碱基的互补关系。在一定的条件下，RNA--DNA形成异质双链的过程称为杂交。其中预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段叫做杂交探针(Probe)，由于大多数植物病毒的核酸是RNA，其探针为互补DNA(complementary DNA，cDNA)，也称为cDNA探针。 核酸检测不仅可以检测到目标病毒的核酸，而且还可以检测出相 近病毒(或核酸)间的同源程度。 * 聚合酶链式反应(PCR)是在短时间内大量扩增核酸的有效方法，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA 区段。从已知序列合成两段寡聚核苷酸作为反应的引物，它们分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补且位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先在过量的两种引物及4种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性。随之将反应混合液冷却至某一温度使引物与其靶序列发生退火。此后退火引物在耐热的洲A聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。每完成一个循环，理论上就使目的DNA产物增加1倍，在正常反应条件下，经25—30个循环扩增倍数可达百万。 PCR扩增在检测标本中病原的核酸序列、由少量RNA生成cDNA文库、生成大量DNA以进行序列测定、突变的分析等方向已经得到广泛的应用。 * 五、物理化学等特征 在植物病毒研究的过程中，人们发现不同的病毒对外界条件的稳定性不同，这便成为区别不同病毒的依据之一。随着新病毒种类的发现和分子生物学研究的深入，人们也逐渐认识到这些物理特性在区分不同病毒中的局限性。 1.稀释限点(Dilution End Point，DEP) 保持病毒侵染力的最高稀释度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的体外稳定性和侵染能力，也象征着病毒浓度的高低。 2.钝化温度(Thermal Inactivation Point,TIP) 处理十分钟使病毒丧失活性的最低温用摄氏温度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有有45℃；最高的是烟草花叶病毒，为97℃；而大多数植物病毒在55—70℃之间； 3.体外存活期(Longevity in vitro，LIV) 在室温(20~22℃)下，病毒抽提液保持浸染力的最长时间。大多数病毒的存活期在数天到数月。 * 4