溶藻弧菌及其检测技术.ppt

溶藻弧菌及其检测技术 宁波出入境检验检疫局 张吉红 2007.1.8 溶藻弧菌 革兰氏阴性兼性厌氧菌，弧菌科，弧菌属; 弧菌属中12种人类致病菌之一; 广泛分布于海水、淡水、海产品中。 致病性 人类： 食物中毒：主要症状为不同程度的头痛、头晕、乏力和腹痛、腹泻、恶心等消化道症状。 肠道外感染 ：经伤口感染人体引起蜂窝组织炎，游泳者为中耳炎，严重者可致脓 毒症 。   水生动物： 是鱼、虾、贝等海水养殖动物的常见致病菌，多发生在夏季，动物体免疫机能下降或环境恶化时也容易发生。 溶藻弧菌检测 生化鉴定 PCR方法检测 检验程序 样品制备 ? 选择性增菌 ? 分离培养 PCR扩增 初步生化鉴定 ? 确证试验 样品制备 样品制备参照SNO173-92： 　 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18 h解冻。若不能及时检验,?应放于－15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于6～10℃冰箱保存,在24 h内检验。 　 取样:以无菌操作进行。?鱼类:取鱼体不同部位（要具有代表性）。?贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类,则应先在清洁的流水中洗刷净外壳,然后以无菌操作打开贝壳,取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。?甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。 以无菌操作称取25 g检样放于均质杯中,以灭菌剪刀充分剪碎。 增菌及分离纯化 将样品接种于225mL 60? g/L氯化钠蛋白胨水中，于37℃增菌18～24h。然后将培养物以接种环划线于硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂(TCBS)平板上。  溶藻弧菌在TCBS琼脂平板上菌落呈黄色、直径2～3 mm、圆形、凸起、光滑、湿润、边缘整齐；菌落粘稠，接种环不易挑取。 初步生化鉴定 在蔗糖琼脂(TCBS)平板上如出现典型或可疑菌落,每个平板至少挑取两个菌落,每个菌落分别接种到下列培养基进行鉴别试验。 ?氧化酶试验 ?? 无盐胰胨水；? ?? 30g/L氯化钠胰胨水； ?? 70g/L氯化钠胰胨水；  ?? 100g/L氯化钠胰胨水； ?? 氯化钠三糖铁琼脂。 氧化酶（Oxidase）试验： 　 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。 　　试验方法：加2-3滴试剂于滤纸上，用牙签挑取1个菌落到纸上涂布，观察菌落反应。阳性反应在5-10 S内由粉红色到紫色。阴性者无颜色变化。 注意： 1.先滴试剂于滤纸上，再涂布菌落到滤纸上。 2.用牙签或玻棒挑取菌落，不可用接种环等金属棒。 3.观察时间不能太长，15min后可出现假阳性反应。 4.试剂要避光保存，若颜色变暗，则弃用。 溶藻弧菌的盐三糖试管斜面为黄色，底层为黄色，不产H2S，溶藻弧菌能发酵蔗糖产酸，而使整个试管显黄色。 接种菌落到100g/L氯化钠胰胨水中时，注意接种量要稍大一些。 嗜盐性试验结果 如上述结果均符合，继续进行以下生化鉴定： 革兰氏染色镜检 ：菌体均被染成红色、两端浓染、无芽胞、呈现卵圆形、杆状或弧状多种形态。 动力试验 ：阳性 42℃生长试验 ：阳性 O/F试验：发酵型 从上述结果可知，溶藻弧菌主要特征为革兰氏染色阴性、两端浓染、无芽胞，呈现卵圆形、杆状或弧状多种形态；具鞭毛、运动活泼、发酵型代谢的专性嗜盐性弧菌，在TCBS琼脂平板上生长良好，菌落呈黄色、直径2～3 mm、圆形、凸起、光滑、湿润、边缘整齐；不能在无盐环境中生长，能在3％NaCl胰胨水、6％NaCl胨水、7％NaCl胰胨水和10％NaCl胰胨水中生长；氧化酶试验为阳性；动力试验为阳性；能在42℃下生长。查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版，可判为溶藻弧菌。 可疑细菌（TCBS平板） 初