恶性疟原虫msp1蛋白c末端19kd蛋白在家蚕杆状病毒表面展示系统中的表达研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

浙江理工大学 硕士学位论文 恶性疟原虫MSP1蛋白C--末端19kD蛋白在家蚕杆状病毒表面展示 系统中的表达研究 姓名：吴昕昕 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：张耀洲 201202 浙江理工大学硕士学位论文摘 浙江理工大学硕士学位论文 摘 要 疟疾(Malaria)是一种由疟原虫造成的，以按蚊为主要媒介传播的全球性 急性寄生虫传染病。疟疾的临床症状主要发生在疟原虫裂殖子孢子在人体红细胞 内无性增殖阶段，目前疟疾疫苗研究的热点主要是基于阻止此阶段疟原虫的无性 裂殖来预防疟疾的感染和发病。恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白lC．末端的19kD片 段(P似SPl 19c)在裂殖子孢子侵染红细胞后仍然存在于红细胞表面，可诱导机 体T细胞和B细胞产生免疫应答，因此是当前疟疾疫苗研制的重要候选抗原位 点。家蚕杆状病毒表面展示技术是近几年发展起来的一种新的真核展示技术，通 过将外源基因与家蚕杆状病毒的糖蛋白基因gp64融合可实现目的蛋白在病毒囊 膜上的表面展示。该技术在单、多克隆抗体的制备、新疫苗的研制等领域己成为 研究热点。 本研究通过将MSPl 19。的基因片段连接到载体pFastBacl-gp64@，成功构建了 真核供体质粒pFastBacl-gp64·MSPl 19c，该供体质粒转化E coli DHl0Bac感受态 细胞后与家蚕Bacmid发生转座得到Bacmid-gp64-MSPll9。。用该 Bacmid-gp64一MSPll9。通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，在细胞内经过装配 形成重组杆状病毒BmNPV-gp64一MSPll9。并复制扩增获得大量重组病毒。通过 PCR检测到MSPll9c基因在家蚕BmN细胞中得到转录表达。用第三代 BmNPV-gp64一MSPll9。病毒以中等感染复数(MOI=10)接种家蚕蛹，7天后收集发 病蚕蛹。Western Blotting及双向电泳检测表明重组杆状病毒在蚕蛹中表达了 MSPIl9。蛋白，证明重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPll9c重组成功。纯化重组病毒 粒子免疫新西兰雄兔制备血清抗体，抗体经Protein A抗体纯化柱纯化后，通过 ELISA检测发现抗体效价达到1：8000以上，表明该重组的病毒能有效刺激机体产 生抗体。 本研究证实了利用家蚕杆状病毒表面展示技术可有效将恶性疟原虫MSPll9c 蛋白展示在家蚕杆状病毒囊膜表面，并且该重组病毒作为免疫原能够刺激机体产 生抗体和免疫细胞，这为一种全新的疟疾疫苗的研制奠定了基础。 关键词：恶性疟原虫MSPl蛋白；家蚕杆状病毒表面展示技术；重组杆 状病毒BmNPV-gp64-MSPl 19。 浙江理工大学硕士学位论文Abstract 浙江理工大学硕士学位论文 Abstract Malaria is a main global acute parasitic vector-borne infectious diseases which caused by a parasite，Transmitted by Anopheles anthropophagus．Clinical symptoms of plasmodium merozoite occurs in blood-stage，the current hot spots in malaria vaccine research was mainly based on blocking this fission stage of Plasmodium clones to prevent malaria infection．After the merozoite spore infecting red blood cells，The merozoite surface proteinl C—fragment(MSPl 19C)is still exist in the red blood ceils membrane surface，T-cells and B—cells Call be induced by the organism immune response，Therefore，this protein is one of the most important of the malaria vaccine candidate antigens sites．Silkworm baculovirus surface display technology is developed in recent years，it is a new form of eukaryotic display technology．We fused The exogenous ge