代谢工程会议.pptx

2015年微生物代谢工程与发酵工程学术研讨会—无锡基于动态代谢组学分析与合成途径动力学模型的代谢途径诊断方法的构建与应用 报告人：刘龙江南大学生物工程学院2015-11-11报告提纲一、研究背景二、系统代谢调控Bacillus subtilis合成N-乙酰氨糖(GlcNAc)三、稳态代谢组学定量解析B. subtilis工程菌代谢特性四、基于GlcNAc合成途径动力学模型的代谢瓶颈诊断与解除五、研究结论1. 发酵工程与代谢工程发酵工程与代谢工程的重要意义:发酵工程利用可再生资源生产燃料、工业化合物及功能营养品，实现绿色经济与低碳经济，微生物菌种选育和构建是发酵工程的基础和核心； 代谢工程已成为微生物菌种选育和构建的重要手段，是发酵工程领域的一个重要分支和研究热点。1.1 代谢工程研究的一般思路与方法微生物代谢工程研究的一般思路:1、基于文献/数据库分析的目标产物合成途径理性设计； 2、代谢产物(目标产物、副产物)合成途径的局部调控；3、工程菌生产特性及代谢网络的系统优化与全局调控；4、动力学/组学分析确定代谢瓶颈，进行新一轮代谢改造。1.2 代谢途径理性设计的一般思路代谢途径理性设计的一般思路:1、文献/数据库/化合物库分析寻找合适的目标产物合成途径(酶) 2、在微生物宿主高效表达目标基因(微生物、动物、植物)3、若文献/数据库无合适的基因(酶)，需首先利用高通量筛选技术筛选获 得目标微生物4、利用比较基因组学和转录组学确定目标产物合成基因(簇)5、根据酶反应特点利用计算机软件模拟并合成人工途径酶1.3 代谢途径优化与调控一般思路与方法终止子工程代谢途径优化与调控一般思路:表达方式优化(游离、整合)启动子工程终止子工程转录因子调控核糖体工程代谢途径(酶)定向进化空间支架构建体外重构反应体系底物转运/产物输出强化表达方式优化启动子工程转录因子调控代谢途径(酶)进化核糖体工程底物转运/产物输出途径强化体外重构反应体系空间支架构建1.4 代谢网络系统优化与整体调控一般思路与方法代谢网络系统优化与整体调控常用方法:全局转录机器工程模块途径工程全基因组规模代谢网络模型构建与调控代谢通路定位工程1.5 代谢网络系统分析的一般方法及不足代谢网络系统分析方法：基于稳态组学数据分析和预测靶点基于稳态流量平衡分析的基因组规模代谢网络模型预测限速步骤胞外重构代谢途径分析合成动力学、鉴定限速步骤目前合成途径起始阶段动力学以及反应动力学模型的研究方法未建立。Analyzing transcriptome, proteome and metabolome in steady state for identifying engineering target胞内代谢物动力学是细胞代谢状态最直接的体现，利用稳态代谢网络分析可发现代谢瓶颈/代谢异常，但不能解释代谢瓶颈/代谢异常产生的原因。在稳态代谢组学分析的基础上，将动态代谢组学和合成途径动力学模拟相结合能鉴定代谢瓶颈/异常及其产生原因，提高对限速步骤的调控能力。 2. 代谢调控B. subtilis 生产N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)N-乙酰氨基葡萄糖应用领域医药领域，治疗关节炎营养保健，延缓衰老化妆品，促进胶原蛋白生成B. subtilis 作为生产菌株的优势可用来生产食品安全级产品遗传背景清晰代谢改造技术成熟不易受噬菌体污染，适于工业化生产blarepBColE1 oripP43NMK7680 bpKmHind IIIgna1bleP43Kpn I 2.1 氨糖合成途径设计与构建—glmS和GNA1基因克隆表达Saccharomycescerevisiae?S288cCaenorhabditiselegans枯草芽孢杆菌中GlcNAc合成与代谢途径 过量表达氨糖合成酶(GlmS)和6-磷酸氨糖乙酰化酶(GNA1)实现了氨基葡萄糖GlcN和N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的初步积累(240 mg/L)。TrypanosomabruceiOryza sativaCandida albicans 2.1 氨糖合成途径设计与构建—GlcNAc转运及分解代谢阻断nagP基因敲除流程图 验证nagA、nagB和gamA基因敲除成功 敲除nagP基因阻断了GlcNAc由胞外向胞内转运敲除nagA、nagB和gamA三个基因进一步阻断胞内GlcNAc降解途径促进GlcNAc胞外积累，产量提高了17倍 2.2 氨糖合成途径优化与调控—GlcNAc合成途径(酶)定向进化氨基葡萄糖N-乙酰化酶GNA1结构模型氨基葡萄糖合成酶GlmS结构模型突变体对细胞生长和GlcNAc合成的影响 2.2 氨糖合成途径优化与调控—GlcNAc合成关键酶表达调控构建基于DNA与锌指蛋白质之间的特异性相互作用的支架系统对GlmS 和Gna1的表