有机物分离与纯化的方、柱层析的一些技巧.ppt

7、一般薄层色谱实验操作 点样—展开—显色—计算Rf值 点样：在距薄板下沿1cm处的水平线上，毛细管口液滴与薄层表面相切，切忌玻璃管戳破薄层，可以重复点样。 展开：薄层板下沿水平插入层析缸，展开剂不能淹没样点，缸内充满展开剂蒸汽，要盖上盖子，展开剂水平线上升，接近薄层上沿时为止。 显色：大多物质要进行物理或者化学方法显色。 薄层板从层析缸取出，在展开剂前沿作一记号，待展开剂挥发干后显色。 物理方法：紫外灯照射；碘蒸汽熏蒸等。 化学方法：可以产生有色物质的反应。 8、影响Rf的因素 薄层厚度 吸附剂种类、活度、展开剂极性、展层的饱和度 展开方法：一般不加黏合剂，薄板水平展开。 单向上行一次展开，倾角70-80° Rf值接近的物质要多次单向展开。每次可用同一展开剂，也可不同的展开剂。 双向展开法：用正方形薄板，展开剂一次走到上沿后取出风干，旋转90°后再展开 边缘效应：溶剂前沿线一般朝下弯造成Rf不准，且使色斑大小及形状不规则 显色是配合薄层进行鉴别。 四、化学提纯法 化学净化法是使杂质与某种试剂发生化学反应除掉或者消除干扰。 有机化合物提取液干扰分析成分很大程度是脂肪与色素。 最常用的化学净化法是用酸处理对酸稳定的有机化合物或用碱处理对碱稳定的有机化合物来除杂。 1、酸净化：用浓H2SO4或浓H2SO4与发烟硫酸（1：1）混合液在分液漏斗中处理萃取液，可以除脂肪、色素。 浓硫酸净化原理 不饱和脂肪，色素中含有C=C，可以和浓H2SO4加成生，成可溶于浓H2SO4的化合物而除去。 硫酸除杂注意事项 １）对酸不稳定的有机化合物如有机磷、氨基甲酸酯不可用。 ２）酸体积与提取液体积之比为1：10；一般净化两次。 ３）提取液脱水不完全或潮天加发烟 H2SO4效果较好； ４）防乳化：第一次净化轻摇，第二次净化猛摇，已乳化可以加水消乳 柱层析的几个技巧 1、硅胶的使用 2、洗脱剂的使用 3、装柱子的技巧 4、上样的技巧 5、过柱的技巧 1、硅胶的使用 初做柱层析很容易把柱子装得长了或短了，有时还会有大量的硅胶剩余，浪费硅胶，这主要是对硅胶等固定相的使用的量没有掌握。柱层析用的硅胶一般是100-200 目，100 毫升硅胶的质量在47 克左右，如果装一个直径是2.8 厘米的柱子，可以装18 厘米高。为了避免浪费硅胶和溶剂，最初学习装柱时最好对实验室中各种不同规格的柱子摸摸底。方法很简单：用量筒量出100 毫升干硅胶，直接倒入各种规格的柱子中，敲实，用刻度尺量出硅胶在柱子中的高度，这样就可以做到心中有数了。一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量，这样就可以大大地节省硅胶的使用，避免造成没有必要的浪费。称量硅胶时一般称30~70 倍于上样量，如果极难分，也可以用100 倍量以上的硅胶。 2、洗脱剂的使用 洗脱剂的极性可用薄层层析来确定，一般以待分离样品Rf 值为0.2-0.3 为宜 选择的洗脱剂应该使两相邻物质Rf 值之差最大化。不要认为在板上爬得高分离的效果就比较好，如果Rf 在0.6，即使相差0.2 也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的过程，可以通过公式的比较：0.6/0.8 一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多，所以分离效果好。 解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时，可用采梯度洗脱的方法，即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。 常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。 对于很难分离的化合物，一是增加柱子的长度和直径，二是减小洗脱剂的极性，这样可以很好地将混合物分开。 在同样能洗脱的情况下，尽量使用毒性小的洗脱剂。例如，乙酸乙酯：石油醚系统和二氯甲烷：石油醚系统，在同样都能洗脱的情况下，应该用毒性小的乙酸乙酯：石油醚系统。 另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，混合溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适。还有一般回收的溶剂中会有少量水分，使用前先要用干燥剂干燥好才能使用。 3、装柱子的技巧 柱层析的装柱非常重要，装柱的效果会直接影响层析分离效果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。 湿法装柱很简单，使用也最普遍，就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆，柱子底部先用脱脂棉塞紧，