Tn5转座酶建库原理.pdf

Tn5 引爆极速建库和长片段之战 近 10 年间 ，NGS （Next Generation Sequencing ）技术高速发展 ，测序仪 器不断更新迭代 ，形成规模化。在测序模式产业化的大环境下 ，测序样本制备成 为其中很重要的一环。样本起始量要求过高、建库流程繁琐等都会限制 NGS 技术 的应 用 。科 学 家 们 一 直 在 不 断探 索 ，试 图突 破 此 类 限制 ，其 中转 座 酶 （Transposase ）技术引入建库中就是很大的进步 ，不仅解决了上述问题 ，转座 酶也在 NGS 上开发了多个技术应用 ，拓展了 NGS 的适用范围。 20 世纪 40 年代 ，美国遗传学家芭芭拉.麦克林托克在玉米的研究中发现了转 座子 （Transposon ），随后 ，她花了整整 6 年的时间来研究转座子的奥秘。在 50 年代 ，当麦克林托克向世人公布她的发现时，学术界并没有多少人认可 ，但是真理是 经得起时间检验的 ，随后的几十年间科学家们在生物界各个领域证实了转座子系 统的广泛存在。1983 年 ，瑞典皇家科学院诺贝尔奖金评定委员会终于把该年度的 生理学和医学奖授予这位 81岁高龄的、不屈不挠的女科学家。麦克林托克是在遗 传学研究领域第一位独立获得诺贝尔奖的女科学家 ，她的名字将和转座基因一起 被载入科学史册。 转座基因俗称跳跃基因 ，它的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识。 理论上的突破也带来了应用上的拓展 ，科学家们群策群力 ，将转座子系统开发成 基因研究的各种工具 ，这又反过来促进了遗传学理论的研究。 转座子标签(transposon tagging)技术是研究功能基因的有效工具之一。比 如模式植物大多都有很好的突变体库 ，其中玉米的两个应用最为广泛的突变体库 （uniformMu 和 Ac/Ds 突变体库 ）就是利用转座子创建的。转座子标签技术克 隆基因的基本原理 ：转座子是染色体上一段可移动的 DNA 片段 ，它可从染色体 的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时 ，就会引起 该基因的失活 ，并诱导产生突变型。通过遗传分析可确定某基因的突变是否由转 座子引起 ，由转座子引起的突变便可以转座子 DNA 为探针 ，从突变株的基因组 文库中钓出含该转座子的 DNA 片段 ，并获得含有部分突变株 DNA 序列的克隆 ， 进而以该 DNA 为探针 ，筛选野生型的基因组文库 ，最终得到完整的基因。 在基因工程中 ，来源于微生物的转座子运用的更为广泛 ，Tn5 就是一个很好 例子。Tn5 因其转座的随机性好、稳定性高、插入位点容易测序等特点 ，已经成 为分子遗传学及基因诊断学研究的热门工具。Tn5 as a Molecular Genetics Tool 作为经典的方法 ，被收录进了 Springer 大名鼎鼎的 《Methods in Molecular Biology》。 Epicentre 的专利产品 EZ-Tn5 转座子突变系统无疑是其中的佼佼者 ，是公认 的易操作系统。该系统经过工程改造 ，使得 Tn5 转座酶比天然转座酶的活性强 100 倍。EZ-Tn5 转座子可在体外插入到含有靶 DNA 的载体上 ，在没有镁离子孵育时 ， EZ-Tn5转座子能够形成稳定的 EZ-Tn5转座体复合体 ，可以通过电击进入活细胞 ， 转座体经细胞内镁离子活化后 ，就能随机插入到宿主的基因组 DNA 中。 图 1A. Tn5 的结构 图 1B. Tn5 插入基因组示意图 2000 年 ，science 上发 表 的 Three-Dimensional Structure of the Tn5 Synaptic Complex Transposition Intermediate解析了 Tn5插入基因组的机理。 Tn5 全长约 5.8kb ，由编码三个抗生素 （新霉素、博莱霉素、链霉素 ）的核心序 列和两条倒置的 IS50 序列组成 （如图 1A ），其中 IS50R和 IS50L 的序列高度同 源 ，只有 IS50L的一个碱基存在突变。IS50具有 19bp的倒置末端（外末端 outside end ，OE 和内末端 inside end ，IE ），两倒置末端有 7 个 bp 不同 ，此倒置末端 是转座酶 （Tnp ）的作用位点。转座发生时 ，两个转座酶分子结合到 Tn5 转座子 的 OE 末