fish基本原理ppt课件.pptx

荧光原位杂交技术原理仪器耗材试剂及配制标本制备探针的制备杂交与检测注意事项一、原理将荧光素直接标记的核酸探针（或生物素、地高辛等标记的核酸探针）与标本中的靶核酸序列按照碱基互补配对原则进行杂交，经洗涤后直接（或通过免疫荧光信号扩增）在荧光显微镜下观察，从而对靶目标中的待测核酸进行定性、定位或定量的研究。二、仪器耗材仪器： 荧光显微镜及分析软件， PCR扩增仪（变性），370C隔水培养箱(杂交)，湿盒，恒温水浴箱，冰箱，普通离心机，小型高速低温离心机，移液枪（1000ul,200ul, 20ul，10ul）,玻片盒，通风橱，震荡混匀器，染色缸、计时器，温度计，温湿度显示器，量筒，酒精灯，烧杯，天平，试剂瓶等。二、仪器耗材耗材： 离心管(50ml,15ml,1.5ml)，PCR管，各种规格的tip头，载玻片（带磨砂的），大盖玻片（ 方形，用于镜检），小盖玻片（一般用圆形，用于杂交时候封片），封片胶等。三、试剂液体LB，氯霉素，STE，BAC试剂盒，异丙醇，NICK试剂盒，无水乙醇，甲酰胺, 20×SSC，2×SSC ，70%酒精，90%酒精，100%酒精，BSA，HumanCotI DNA，50%硫酸葡聚糖，0.3%NP40/0.4SSC， PBS缓冲液，0.1%NP40/2×SSC，DAPI 染色液等。四、标本制备 按第四章人淋巴细胞培养及收获及染色体制备收获外周血中期染色体，调整悬液浓度（20倍物镜视野下20-30个细胞，分裂指数在4%以上为宜），悬液-200C保存。五、探针的准备BAC-DNA的抽提标记纯化1、BAC-DNA的抽提无菌操作台上，接种BAC菌种7ul于含氯霉素（氯霉素终浓度为30ug/ml）的15ml液体LB培养液中，空气摇床上37℃，280rpm，震荡培养18-20h。4000 rpm，4℃，离心10min去上清，加入5mlSTE(冰预冷)重悬4000 rpm，4℃，离心10min去上清，加入250ul P1 (冰预冷)重悬转入1.5mlEP管中(冰预冷5min)加入250ul P2(预温)轻轻转6次，室温静置5min加入250ul P3(冰预冷)轻轻转6次，冰上5min13200 rpm，4℃，离心10min1、BAC-DNA的抽提移上清至新的EP管（冰预冷），加入700ul异丙醇，混匀13200 rpm，4℃，离心10min去上清，加入1ml 70%无水乙醇混匀13200 rpm，4℃，离心10min去上清，加入15ul Nuclease-free water溶解DNA室温放置2、标记探针采用缺口平移标记法（NICK试剂盒）在0.5mlEppendorf管中加入： Nuclease-free water 13.5ul dNTP mix （0.1mM） 10ul dTTP（0.1mM） 5ul 10×buffer 5ul 模板DNA（1-1.5ug） 6ul SpectrumGreen 或 SpectrumOrange 或 SpectrumRed dUTP（0.2mM） 2.5ul Nick translation enzyme 8ul 总体积50ul2、标记探针上PCR仪：15℃ 8小时75℃ 10分钟灭活4℃保存取标记后的探针5ul跑1%琼脂糖凝胶电泳检测，标记后探针长度范围在100-400bp较好（稳定，达到5000bp）3、纯化探针在1.5mlEppendorf管中加入： E．coli tRNA（1ug/ul） 1ul 鲑鱼精DNA（10mg/ml）5ul 8M醋酸胺 6ul 糖元 （10mg/ml） 1ul 4℃保存。3、纯化探针将标记好的探针加入上述Eppendorf管，再加入-20℃无水乙醇200ul，-70℃放置30分钟4℃，15000rpm，离心10分钟去上清，加入200ul70%乙醇4℃，15000rpm，离心5分钟吸去乙醇，立即加入甲酰胺25ul室温，避光，溶解10分钟，-20℃保存六、杂交与检测外周血玻片准备杂交体系准备杂交洗脱结果观察1、外周血玻片准备75℃烤箱烘烤2小时置于2×SSC 中30min依次放入70%，90%，100%酒精中各2min室温干燥2、杂交体系准备 在1.5mlEppendorf管中加入 20×SSC 1.5ul BSA（1ug/ul） 1ul HumanCotI DNA （1mg/ml） 2ul 探针 3.75ul 甲酰胺 3.75ul 50%硫酸葡聚糖 3ul 总体积15ul3、杂交PCR扩增仪开启，使温度达到80℃滴加配好的杂交液15ul于杂交区盖上盖玻片，封胶，PCR扩增仪80℃变性2min将玻片置于湿盒，放入37℃杂交16小时