rd细胞肠道病毒71型受体筛选和初步鉴定-screening and preliminary identification of type 71 receptor for rd cell enterovirus.docx

缩写PAGE英文全称Polyacrylamide gel electrophoresis中文全称聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS PEG PMSF PSDTPSGL-1Phosphate buffered saline Polyethylene glycol Phenylmethanesulfonyl fluoride Phage surface display techniquesP-selectin glycoprotein ligand-1磷酸盐缓冲液聚乙二醇 苯甲基磺酰氟 噬菌体表面呈现技术P-选择素糖蛋白配体-1RDRhabdomyosarcoma人横纹肌肉瘤RT-PCRReversetranscriptionpolymerasechain reaction反转录聚合酶链式反应r/m，rpmrevolutions per minute转数/每分SCARB2Scavenger receptor class B member 2清道夫受体 B2 SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基磺酸钠secSecond秒SLP-2stomatin-like protein 2SLP-2 蛋白TCID50Tissue Culture Infective Dose 50%组织培养半数感染量 TrisTrihydroxymethyl aminomethane三羟甲基氨基甲烷 μgMicrogram微克μLMicroliter微升UTRUntranslated Region非编码区VVolt伏特VAPVirus attachment protein病毒吸附蛋白 VOPBAVirus overlay protein-binding assay病毒覆盖蛋白结合法 WBWesterBlot免疫印迹RD 细胞肠道病毒 71 型受体的筛选和初步鉴定研究生：胡小云导师：朱冰 教授专业：临床检验诊断学中文摘要研究背景：肠道病毒 71 型(EV71)属于小 RNA 病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的成员， 是引起儿童手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD) 暴发流行的主要病 原之一。EV71 感染不仅可以引起儿童手足口病，严重者还能引发一系列与神经 系统相关的并发症如无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心 肌炎和肺水肿等，病死率高。EV71 病毒受体的鉴定对于明确病毒感染的宿主范 围、组织和细胞嗜性，明确病毒-宿主之间的相互作用和致病机理有着重要的作 用。目前 EV71 受体的研究已经取得突破性的进展，已鉴定出 EV71 的两个不同 受体: SCARB2 和 PSGL-1。因为 PSGL-1 主要在白细胞上表达，所以它不可能在 非白细胞（比如神经细胞，上皮细胞）上作为受体。此外，用两者的配体或抗体 都无法完全阻断 EV71 对宿主细胞的感染。这些都提示 EV71 受体不只一种， PSGL-1 是否为第二受体，与 PSGL-l 无关的 T 细胞感染是否由 SCARB2 介导或 是由其它受体介导还未可知。由此推测，应当存在一种或多种未知的 EV71 受体 或受体辅助分子。研究目的：筛选和鉴定RD细胞上能与肠道病毒71型（EV71）VP1蛋白结合的受体蛋白， 为进一步深入研究EV71病毒受体特性和功能提供实验依据。研究方法：1、 EV71病毒的快速纯化及鉴定：EV71病毒在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)细胞中 增殖后，收获的细胞培养物经反复冻融、聚乙二醇6000沉淀、差速离心、氯 化铯垫层超速离心的方法纯化病毒。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)、 免疫印迹(Western blot)和透射电镜(TEM)的方法对纯化病毒进行鉴定，并测 定其感染性滴度及回收率。2、 EV71病毒候选受体的筛选：大量培养RD细胞后提取膜蛋白，双向凝胶电泳 分离RD细胞膜蛋白后，通过Far-western 印 迹实验筛选能与EV71病毒VP1 蛋白相互作用的RD细胞膜蛋白，同时设立阴性对照，利用基质辅助激光解 吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对特异性结合的蛋白点进行鉴定。3、 病毒候选受体的初步鉴定：采用免疫共沉淀试验来验证SLP-2蛋白与EV71病 毒之间的相互作用。研究结果：1、 病毒纯化后经SDS检测后显示出三条带，相对分子量分别为34KD、30KD、26KD与EV71的VP1、VP2和VP3蛋白相符合。Western blot证实34KD 的条带为EV71的VP1蛋白。经磷钨酸负染后电镜观察，能看到典型病毒颗粒。 终浓度为10%的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率为82%，再经氯 化铯垫层超速离心后浓缩病毒的感染性回性率为29.0%。2、 通过Far-western 印迹 检测