抗体的制备讲解课件.ppt

抗体的制备 李成仁 组织学与胚胎学教研室 单克隆抗体的特点 抗体的性质相同，容易纯化、标记。 特异性强，具有抗原结合位点的专一性。(不是抗原的专一性！) 因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。 但单克隆抗体有交叉反应 是由于不同的抗原上有完全相同的表位(100%的交叉反应)，或有相似的表位(不同程度的交叉反应)。 多克隆抗体的特点 多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。 比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。 购买抗体时要注意厂商的标注 适合于做什么实验，使用浓度多少 WB（Western blotting ，免疫印迹) IHC (Immunohistochemistry, 免疫组织化学) ICC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学) IEM (Immunelectron microscopy,免疫电镜) FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪) ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶联免疫吸附实验，酶联免疫分析) 1. 颗粒性抗原的制备 (1)红细胞抗原的制备： A、新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细胞并配制成2~5%，直接进行注射免疫。 B、新鲜血+抗凝剂— 4℃保存4W，免疫前取适量抗凝绵羊血，按A处理。 C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。 (2)细菌抗原的制备：取标准菌株，接种。 H抗原：取有动力的菌株液，用0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h。 Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶液。 (3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫卵悬液。 (4)组织细胞粗抗原：所用的组织必须是新鲜或处理后低温(-40℃)保存的。器官或组织材料得到后立即去除表面的包膜或结缔组织及大血管，用无菌NS进行灌注、洗涤至没有残血、污物，在冷浴中将组织剪成小块后粉碎(匀浆)/消化。 粉碎方法有两种，一是高速组织捣碎机法：注意要高速(1万rmp)，间断(每次30秒~1min)进行，时间过长会导致产热，破坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过的海沙使研磨更有效)。 匀浆液经离心，沉淀中含大量的组织细胞和碎片，上清液可提取可溶性抗原。 消化是用胃蛋白酶或胰酶，通过酶解将细胞间质消化，获得游离单个细胞。 2. 可溶性抗原的制备 可溶性抗原可分为：细胞膜蛋白抗原、细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。 (1)细胞破碎：有如下方法： A、反复冻融法：置-15~-20 ℃冻结，然后缓慢融化，反复2次，大部分细胞因胞内冰晶的形成和溶剂浓度的突然改变而被融破。此法适用于组织细胞，对微生物的细胞作用较差。 B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用此法。 C、超声波破碎法：是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的方法。微生物和组织细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则较难打破。 D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用于多种微生物。 E、表面活性剂处理：在一定的条件下，表面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡，使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。提取核酸时常用此法。 F、自溶法：利用组织和微生物的自身酶系，在一定条件下使细胞溶解。 (2)蛋白质抗原的制备：破碎的细胞按一定要求纯化，可获得不同成分的抗原。 A、超速离心法：利用各抗原在梯度液中沉降速度不同，达到区带分离的目的。这是分离亚细胞部分和蛋白质大分子的有效手段。 B、选择性沉淀：是采用各种沉淀剂或改变条件使抗原成分沉淀而达到分离的目的。 a、核酸除去法：用DNA/RNA酶降解或用氯化锰/硫酸鱼精蛋白/链霉素作沉淀剂去除核酸。 b、盐析沉淀法：用不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠。例如:用40、35、33%的硫酸铵分次提取或用20%硫酸钠提取，即可获得丙种球蛋白(含IgG 95%以上) 。 c、有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低而沉淀，有些有机溶剂能破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀，例Cohn地温酒精可将血浆蛋白分为五组。IgG属CohnⅢ。 d、其它沉淀剂：常用聚乙二醇(PEG)和硫酸葡聚糖。PEG浓度3~4%可沉淀IC，6~7%沉淀IgM，8~12%沉淀IgG，12~15%沉淀其它球蛋白，25%则沉淀白蛋白。 C、