停乳链球菌内蒙古分离株mig基因的克隆和表达-预防兽医学专业论文.docx

目录1引言11.1奶牛乳房炎概况11.2奶牛乳房炎病原微生物11.3奶牛链球菌性乳房炎乳研究进展21.4停乳链球菌概述21.5停乳链球菌毒力因子31.6链球菌性乳房炎的防治31.7链球菌疫苗研究进展31.8本研究的意义和主要研究内容42实验一停乳链球菌MIG基因的克隆52.1材料与方法52.1.1材料52.1.2实验方法72.2克隆载体的构建82.2.1MIG的PCR扩增82.2.2PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测92.2.3MIG基因片段的回收与纯化102.3质粒PMD19T-MIG的构建102.3.1E.coliDH5α感受态细胞的制备（采用CaCl2法）102.3.2与T载体的连接112.3.3连接产物的转化112.3.4质粒的提取122.3.5质粒的双酶切鉴定122.3.6重组质粒的序列测定及分析132.4结果132.4.1目的基因的PCR扩增132.4.2重组表达质粒的酶切鉴定142.4.3MIG的序列测定及相关分析152.4.4结果分析193实验二MIG基因的原核表达质粒的构建和表达193.1材料与方法193.1.1材料193.1.2方法SDS分析253.2结果253.2.1重组表达质粒的酶切鉴定253.2.2测序结果263.2.3可溶性鉴定及最佳诱导时间的确定263.3结果分析273.3.1减少包涵体的形成273.3.2本实验最佳裂解方法的确定284实验三重组蛋白的纯化及免疫试验研究284.1材料与方法284.1.1材料284.1.2方法294.2结果334.2.1目的蛋白的纯化334.2.2重组蛋白浓度的测定344.2.3透析及浓缩354.3结果分析374.3.1蛋白的纯化及透析374.3.2大肠杆菌表达系统384.3.3抗体水平检测385讨论385.1基因工程亚单位疫苗抗原的选择385.2停乳链球菌MIG基因克隆和表达395.3免疫405.4停乳链球菌蛋白受体406结论42致谢43参考文献44作者简介481引言1.1奶牛乳房炎概况奶牛乳房炎是由多种病原菌引起的奶牛的常见病之一，也是对世界奶牛业造成经济损失最大的疾病之一。它不仅影响奶牛的产奶量，降低奶牛养殖业的经济效益，而且危害人类身体健康。我国奶牛乳房炎的发病率很高，特别是隐性乳房炎危害更大。据孙福先等[1]、杨章平等.和李国江等[3]的调查结果表明，我国奶牛隐性乳房炎阳性率分别为85.7%、54.1%、46.4%。李国江等[3]报道，每头患隐性乳房炎的母牛日平均产奶量减少3.7kg。全世界范围内由乳房炎引起的牛奶损失每年高达3800kt，每年经济损失约为3000亿元。我国每年因奶牛乳房炎造成经济损失已超过8亿元。由此可见，乳房炎对乳业经济有巨大的影响。1.2奶牛乳房炎病原微生物引起奶牛乳房炎的致病菌种类繁多，目前已知的致病菌约有150多种，其中常见的有20余种[4]，奶牛乳房炎主要致病菌有：大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)[5]等。据国内外学者报道引起奶牛乳房炎的致病菌80%以上为链球菌和金黄色葡萄球菌[6-9]。大肠杆菌是环境性病原体，由大肠杆菌引起的乳房炎多见于舍饲奶牛，感染后很快转变为临床型乳房炎。金黄色葡萄球菌引起的乳房炎大多是因为乳区感染所导致的，金黄色葡萄球菌不但可导致奶牛临床型乳房炎，也可导致隐性乳房炎。大量的研究表明，金黄色葡萄球菌多在奶牛泌乳高峰期引起感染，常表现为慢性经过，但有时也可导致急性发病[10-17]。停乳链球菌是干奶期奶牛乳房炎的主要致病菌，该菌能和金黄色葡萄球菌、无乳链球菌混合感染损伤部位，且能够在损伤部位增殖。奶牛感染停乳链球菌时常见的临床症状为：发烧、乳房肿胀、触诊呈捏粉样并伴有异常分泌物。无乳链球菌是隐性乳房炎的主要致病菌，是高度传染性专性乳腺寄生菌。它主要导致乳腺的慢性感染，降低产奶量[18]。乳房链球菌常见于奶牛的泌乳早期和干奶期，是主要的环境性链球菌。从奶牛的唇部、阴道、乳区及牛舍均可分离到。乳头皮肤的损伤和皲裂都有助于乳房链球菌的定殖，大大增加了感染机会[19]。即使挤奶后消毒乳头也不能减少病原感染。奶牛乳房炎各地区病原菌感染情况也不同，据袁永隆等[20]报道天津、兰州、广州、昆明、重庆、柳州等地的奶牛场均以无乳链球菌为主；长沙、郑州等地的奶牛场以停乳链球菌为主；青岛、北京等地以金黄色葡萄球菌为主,个别奶牛场以克雷伯氏菌占首位。内蒙古地区大型奶牛场及小型