基因工程的操作过程zp教程.ppt

DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。 DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液。 RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液，先提取得到RNP。 　提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。 蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。 去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。 有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。 取小鼠肝组织匀浆 处死小鼠 匀浆 RNA纯化操作步骤 加入氯仿0.2ml，剧烈振荡，室温放置10分钟。12000rpm离心15min，取上清。（离心后溶液分为三相，即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相，绝不能有中层蛋白混入。） 加入异丙醇0.5ml，振荡混匀，室温放置10分钟，12000rpm离心10min，弃上清。（加入50％的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当。） 1ml 75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，重复一次。 空气干燥沉淀，溶解于20μl DEPC-H2O。留样2μl，其余－70℃保存备用。 RNA电泳操作步骤 制备琼脂糖凝胶：首先将0.5g琼脂糖溶化于32ml水，冷却至60℃。加入5×甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml，37％甲醛水溶液9ml，混合均匀并灌制胶板。 取1μl RNA溶液，加入甲酰胺-上样缓冲液9μl，95℃变性5分钟，迅速冰浴冷却。点样。 150V电泳30分钟，紫外灯下观察电泳结果。 分光光度法操作步骤 加1μl RNA溶液于0.4ml DEPC-H2O，充分混匀，读取260nm与280nm的吸光度数值。 操作注意事项（一） 因为RNA酶分布广、活性强、且难以失活， 使RNA极易降解，操作时应特别注意： 高压消毒实验器皿，烤干。 以0.1% DEPC过夜处理所有试剂配置用水，并高压消毒。 抽提RNA时，应戴手套和口罩，少说话。 操作注意事项（二） DEPC是强烈的烷化剂，通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶活性，是消除外源性RNA酶的主要方法。但DEPC有致癌作用，并具有很强的反应性，因此注意： 使用时，不直接接触 DEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理，使DEPC分解后使用。 蛋白质（酶）的提取 大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。 对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。 盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。 （2）等电点沉淀 蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 （3）有机溶剂法 与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个： 降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。 是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。 室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂