八组织培养第八章　原生质体培养演示幻灯片.ppt

第八章 原生质体培养 宜职院08.9 目的与要求 掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。 具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。 一、原生质体概念 原生质体：原生质体去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。 二、原生质体培养意义： 1、原生质体没有细胞壁，有利于细胞融合，体细胞杂交，基因转移和单细胞培养。 2、原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质，作为理想的受体系统进行各种遗传操作的研究，实现体细胞杂交在植物遗传育种方面的应用。 第一节 原生质体的分离与纯化 一、原生质体的分离 （一） 材料来源 叶片，花瓣，果实组织，花瓣髓部，子叶等，尤其是叶肉细胞及由各部分形成的培养细胞和悬浮细胞。 （二）分离方法 1、机械分离法 产生质壁分离——释放原生质体 缺点： 原生质体的产量很低；方法繁琐费力；因必须高度质壁分离，故局限性大。 优点： 能够排除外加酶对离体原生质体的结构和代谢活性的有害影响。 2、酶分离法 收率高、活力强、完整性好。分离原生质体最有 效。 （1）酶的种类及特点 分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂，以其所含的主要酶的作用分为： 1、纤维素酶类 2 半纤维素酶类 3 果胶酶类 4 崩溃酶 5 蜗牛酶 （2）酶液的配制 1、酶的配比和浓度 2、渗透压和稳定剂及PH。 （3）分离原生质体 1、两步分离法。用果胶酶离析植物组织，收集细胞，经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。 2、一步分离法。一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。 叶肉原生质体分离纯化 纯化后的叶肉原生质体 二、培养方法 1、液体浅层培养 原生质体（约2×105/ml密度）悬浮在液体培养基—将悬浮物质移到直径为60cm的平皿中（2-3mm为宜）—5-10天后开始原生质体分裂 特点：通气好，原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害，转移添加新鲜培养基方便，便于观察和照相。操作简单，可微量培养，细胞植板率高。但原生质体沉淀，分布不均，细胞团聚集多，难成单细胞株系。 2、平板法培养 原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合—置于6cm培养皿（2-3mm）,暗培养—5-7天原生质体开始分裂 特点：原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系，可定位观察。原生质体易受热伤害，易破碎，原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。 3、悬滴法培养 将含一定密度原生质体的悬浮液，滴在6cm培养皿盖内侧上，皿底加入培养液和渗透剂等液体保湿，此时培养小滴悬挂在皿盖内。 特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可做原生质体不同密度的培养对比试验，进行单细胞培养。 4、双层培养法 固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。 特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原生质体易受热伤害，易破碎。 5、饲喂培养法 将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。 特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。 三、培养条件 25-27℃，光照16h/d，最初几天经常摇动，以助透气。四、原生质体存活率、密度及产量的测定（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100%（二）测定原生质体的密度 原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）×104×稀释倍数 （三）原生质体产量的测定 Y=DV / FW Y（个/g）——原生质体产量 D（个/ml）——存活原生质体密度 V（ml）——制备所得原生质体悬液的总体积 FW（g）——制备原生质体所用材料的鲜重