内毒素对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的影响.pdf

第6届家畜内科学学术研讨会论文集 内毒素对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的影响 索占伟 韩博2穆祥h (1．北京农学院动物科学技术系．北京102206 2．中国农业大学动物医学院，北京100094) 捕要：为了探讨肠黏膜微血管内皮细胞在肠道细菌性疾病中的作用，通过体外培养大鼠肠黏膜微血管内皮细胞。 观察了大肠杆菌内毒素(LPS)对其形态学的影响，并采用比色法检测了LPs对肠黏膜徼血管内皮细胞分泌NO和明’-l 的影响。结果表明：LPS作用后肠黏膜微血管内皮细胞形态发生明显的变化，细胞间隙增大，长宽比增加；与正常组相 比，LPS组细胞分泌NO和ET-I的量均显著升高。并且随其作用时阉的延长，ET-1／NO急剧增加。 关键词：微血管内皮细胞；肠黏膜；热敏肠毒素；NO；ET-1／NO 细菌性疾病是严重危害养殖业的一大疾病，不但引起动物腹泻，还可导致死亡，给畜牧养殖业造 成了重大的经济损失。越来越多的研究表明，细菌产生的各种致病因子即细菌毒紊对动物机体的作用， 是引起疾病甚至死亡的主要原因。细菌内毒素是大部分革兰氏阴性菌释放的重要致病因子，现已证明 其作用的靶细胞是微血管内皮细胞。肠黏膜微血管内皮细胞作为肠道黏膜的重要屏障，是细菌毒素吸 收和作用的原始位点。因此，改善肠黏膜微血管内皮细胞功能，抑制内毒素对微血管内皮细胞的伤害， 对防治细菌内毒素引起的肠道性疾病有着重要的临床意义。本研究旨在研究内毒素对肠黏膜微血管内 皮细胞的影响，以便为肠道细菌病的病理研究提供资料，为防治肠道细菌病的药物开发奠定试验基础。 1．材料与方法 1．1主要材料与试剂 1．1．1大鼠肠黏膜微血管内皮细胞：采用本实验室培养的第五代细胞，培养方法详见文献【ll。 自Sigma公司)o 1．1．3 NO检测试剂盒：购自深圳晶美生物工程公司。 1．1．4 ET—l一1检测试剂盒： 购自AssayDesigns公司。 1．1．5 LPS：购自Sigma公司。 链霉素(购自华北制药股份有限公司)。 1．2大鼠肠黏膜徼血管内皮细胞传代培养及鉴定 选取第五代大鼠肠黏膜微血管内皮细胞，进行传代，平均接种于48孔培养板内，使其数量为1．0 ×104／ml，其中2孔置人清洗灭菌的盖玻片中，静置培养。待细胞铺满盖玻片时，取出盖玻片，进行第 X Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定。其它细胞定时计数，待细胞数量增至1．010‰时，用于试验。 1．3I工蛋对肠粘膜微血管内皮细胞形态的影响 选取15孔细胞，分为对照组、LPSl组、LPS2组。每组设五孔。试验前对各组细胞换液，依次加 LPS的培 人0．5mL不同的培养液，对照组加正常培养液，LPS!和LPS2组分别加含l弘g，mL和lO№／mL 养液。然后置入370C、5％C02培养箱中静置培养，12h后在倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化， 拍照并记录。 第6届家畜内科学学术研讨会论文集 1．4I卫lS对肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO和ET_1的影响 另选40孔细胞，分为对照组和LPS试验组。细胞在试验前换液，在各孔中依次加入0．5mL不同的 LPS的培养液，置入37℃、5％C02培养箱中静置培 培养液，对照组加正常培养液，LPS组加含1她／mL 参照NO和ET-1检测试剂盒(硝酸还原酶法)说明，依次检测计算NO和ET—l的含量。 1．5数据统计学处理 所有数据均以X±S表示，采用t检验进行显著性分析。 1．6 I腭作用时间对ET-l／NO比值的影响 按1．4步测出的结果分别计算各时间段细胞上清液NO和ET一1含量的平均值，并将3h对照组的 ET一1／NO规定为1，其它组均与此作比较，计算各组细胞在不同时段分泌两种因子的相对比值。 2．结果 2．1肠黏膜微血管内皮细胞培养及鉴定