构建双元载体.ppt

一、研究背景 Ｍagnaporthe grisea是构成稻瘟病的主要因素 萌发管和半球形附着胞是其孢子感染时期的特殊结构 此真菌的基因序列已经测定出来，并且1000多种基因的功能已被注解，但大部分基因的功能还未知 此文就用根癌农杆菌的介导方法(AMT)来进行插入突变和基因敲除，以此来分析基因的功能 并利用绿色荧光蛋白(GFP)基因来监视目的基因的外观表达，有利于对其功能的理解 二、实验原理 GFP标记的基因敲除(GGKO)方法可以使基因敲除后的突变产物与带有GFP的转化子同时产生，后者在目的基因的原始启动子的控制下产生的 针对上述方法构建了一个载体系统 GateWay克隆系统可以使大型的双元载体构建简单 采用AMT法得到更高的转化效率 三、实验过程 １．载体的构建 a.入门载体：PETHG pCR8/GW/TOPO PETH GFP PtrpC-HPT ( from pBIG2RHPH2) PETHG 注：PtrpC-HPT是受trpC启动子调控的潮霉素Ｂ磷酸转移酶序列 b.　pETHG-(target)KO载体的形成 　　　　　　　　　　　　 注：UFR(目的基因的上游区域)：包含了启动子区域 　　DFR(目的基因的下游区域)　 c.目的载体pCAMBIA-Bar-RfA的形成 PtrpC-Bar(来自于pBIG4MRBrev) 　　　 pCAMBIA-0380的SalⅠ位点 　　RfA:入门载体转换系统 pCAMBIA-Bar pCAMBIA-Bar－RfA 注：PtrpC-Bar是受PtrpC调控的抗双丙氨磷序列，可区分敲除靶基因后　 的转化子与T-DNA异常插入而形成的转化子 d. LR结合反应形成最终敲除载体pCAMBIA-(target)KO 注：ＬＲ反应前先用ApaⅠ或PvuⅡ酶解PETHG-(target)KO来增加LR反应效率 生成的pCAMBIA-(target)KO作为敲除用的最终载体通过电击法导入农杆菌EHA105内 ２．致病菌和目的基因的选择 致病菌：M.grisea Ina86-137品系(从日本水稻中　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　分离出的致病菌） 目的基因：a. MGG09248 　　　　编码一种几丁质结合模块 　　　　　b. MGG06594 　　　　 编码一种类似于几丁质合酶的蛋白 ３．根癌农杆菌介导的遗传转化 a.　M.grisea与农杆菌的共培养 　 M.Grisea的孢子在铺有滤纸（直径为90mm)的PDA上培养３d以形成菌丝体，再将农杆菌悬液倒入该滤纸上，使两者共培养，产生的转化子可以经在含有500ug/ml潮霉素和25ug/ml美罗培蓝的PDA中培养筛选出来，本文实验平均每片滤纸上可得到10~30个抗潮霉素Ｂ的转化子，将抗潮霉素的克隆子分别影印在含有和不含有20ug/ml bialaphos(双丙氨磷）的PDA上 注：PtrpC-Bar片段可区分靶基因被敲除的转化子与T-DNA的异常插入所形成的转 　　化子 b. 经PCR检测靶基因是否被敲除，并最终用Southern分析证实 用于PCR分析的真菌DNA制备参照Saitoh等人提出的一个简单方法 用于Southern分析的DNA可用苯酚－氯仿从原生质体中提取出来 本实验用DIG标记的探针进行Southern杂交，可检测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小 四、实验结果 MGG09248基因： 　　620-bp UFR和570-bp DFR用于同源重组 　　从第一轮筛选所得到的18个抗潮霉素转化子中有12个是对双丙　　　　　 氨磷敏感的，而这12个中的９个转化子被证明是敲除突变株 MGG06594基因： 630-bp UFR和624bp DFR用于同源重组 从第一轮筛选所得到的21个抗潮霉素转化子中有16个是对双丙　　　　　氨磷敏感的，而这16个中的14个转化子被证明是敲除突变株 但这些敲除了基因后的突变株，在形态学上和在对水稻的致病性上与之前并没有表现出改变。 分析原因： 　　因为T-DNA左边界旁边的筛选标记比放在右边界更易被删除，而利　　　　用PtrpC-Bar片段位于其右边界附近的载体可以增加敲除的效率；但是敲除效率最终是由这个基因决定的 　　 显微镜下的观察 方法： 选在PDA培养基中正处于生长期的MGG09248和MGG06594基