底物抑制剂辅助胰蛋白酶复性.doc

K016 底物抑制剂辅助胰蛋白酶复性 黄星 马帅耒 闫明 刘铮 （清华大学化学工程系，北京 100084） 摘 要 酶可以与底物或者底物抑制剂特异性结合，由诱导契合(induced-fit)理论可知，酶蛋白与 底物结合并不是底物与活性部位的密切互补匹配，而是在底物诱导下酶分子发生一定程度的构象 变化，与底物发生互补契合。这启发我们考虑利用底物或者底物抑制剂来诱导蛋白质活性部位正 确结构的形成，实现蛋白质体外复性。本研究旨在以 trypsin（胰蛋白酶）为模型蛋白质，以 benzamidine（苯甲脒）为底物抑制剂，考察 benzamidine 对天然 trypsin 活性的影响，优化 trypsin 复性。首先，考察了底物抑制剂 benzamidine 对 trypsin 非还原、还原变性的影响。实验表明，非 还原条件下，benzamidine 有维持天然 trypsin 活力的作用。但在还原变性时，则没有这种作用， 说明二硫建在维持 trypsin 正确的三维结构中起着更为重要的作用。进而，用 8M 尿素和 30mM DTT 对 trypsin 进行了还原变性，考察了 benzamidine 浓度对 trypsin 复性的影响，发现二者的摩尔分子 数比大于 250 后，benzamidine 对 trypsin 产生明显的活性抑制作用，因此在复性操作中应将此分 子数比控制在小于 250 的范围内。实验还确定了复性的最佳 pH 为 7.0，氧化还原试剂 GSSG 和 GSH 均为 1mM。最后，尝试了用固定了 benzamidine 的凝胶辅助 tyrpsin 复性。在逐步降低尿素 浓度的同时使变性 trypsin 逐步复性，并吸附到凝胶上，复性结束后，对 trypsin 进行洗脱、分离， 发现固定化的 benzamidine 有更好的复性效果，表明可实现 trypsin 的复性与分离耦合。 关键词 蛋白质复性 抑制剂 胰蛋白酶 苯甲脒 固定化 引 言 重组蛋白质的复性过程中常会遇到蛋白质错误折叠与聚集问题，这些将导致蛋白质复性 率降低并使后续纯化过程变得复杂。依据对蛋白质体内折叠过程的认识，研究者们采用分子 伴侣类型的添加剂来辅助蛋白质结构的形成[1~3]。酶作为功能性蛋白质，可以与底物或者抑 制剂特异性结合，由诱导契合(induced-fit)理论可知[4]，在酶催化过程中，酶在底物诱导下发 生一定程度的立体形变而成为具有催化活性的构象。这启发我们考虑采用底物或者抑制剂来 诱导蛋白质活性部位结构的形成，从而实现变性蛋白质的体外折叠和复性。 为考察上述设想的可行性，本文以胰蛋白酶（Trypsin）及其抑制剂苯甲脒（Benzamidine） 为研究体系，通过实验考察了 Benzamidine 辅助 Trypsin 复性过程的特性以及主要影响因素， 发现并证实 Benzamidine 具有诱导 Trypsin 活性结构形成的功能，采用固定化 Benzamidine 实现了 Trypsin 复性与纯化过程的耦合。本文实验结果证实了以抑制剂辅助蛋白质折叠这一 新复性方法的可行性，并显示出此方法特别适宜于那些在水溶液中易于发生自降解的蛋白质 复性。 1 1 材料与方法 1.1 实验试剂与设备 主要试剂包括猪胰蛋白酶 Trypsin （Sigma, USA ），Benzamidine （Sigma, USA ）， N-Benzoyl-Phe-Val-Arg p-Nitroanilide Hydrochloride（Sigma, USA），Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride（BAEE）（ICN，USA），二硫苏糖醇（DTT）（Bebco, USA），还原 型、氧化型谷胱甘肽（GSH, GSSG）（Roche, Switzerland），三羟基氨基甲烷（Tris）（Amersham, Sweden），尿素（Urea）（Merck, Germany）。 吸光度的测定采用 6010 型紫外－可见分光光度计（上海惠普）和 Spectra MAX190 型 酶标仪（Molecular Devices，USA）。 1.2 胰蛋白酶的变性操作 变性液（简称 DB）为 pH8.6, 0.10 mol·L-1 Tris-HCl 含 8.0 mol·L-1 Urea、0.020 mol·L-1 DTT 和 1.0 mmol·L-1 EDTA。用变性液配置 50 mg·ml-1 的 Trypsin 溶液，37oC 保温 3 h 使其彻底变 性，置于 4oC 冰箱中备用。 1.3 胰蛋白酶的复性操作 复性操作在 4oC 下进行，复性缓冲液（简称 RB）为 pH7.8, 0.1