苹果炭疽叶枯病菌GcAP1复合体β亚基基因的克隆及-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2017,50(8):1430-1439 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.007 苹果炭疽叶枯病菌GcAP1复合体β亚基基因的克隆及功能分析 张俊祥，冀志蕊，王娜，徐成楠，迟福梅，周宗山 （中国农业科学院果树研究所，辽宁兴城 125100 ） 摘要： 【目的】明确衔接蛋白（adaptor protein）GcAP1 复合体β亚基在苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)生长发育和致病过程中的功能，检测 GcAP1β在该菌中的时空表达模式，并揭示其是否调控多聚半乳 糖醛酸内切酶（endopolygalacturonase）基因 CgPG1 和 CgPG2、果胶裂解酶（pectin lyase）基因pnl-1 和 pnl-2 以及果胶酸酯裂解酶（pectate lyase）基因pelA和 pelB的表达，为深入开展苹果炭疽叶枯病菌衔接蛋白在致病 信号传导途径中的分子机制研究打下基础。【方法】通过构建 GcAP1β基因敲除载体和 GcAP1β-gfp 融合表达载 体，利用农杆菌介导的遗传转化技术（ATMT）获得Δgcap1β突变体和 GcAP1β恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β，并 由 RT-PCR 和 Southern 杂交分析进行鉴定。以野生型菌株 W16 为对照，对Δgcap1β突变体和 GcAP1β恢复菌株 Δgcap1β-GcAP1β的生长速度、产孢能力、分生孢子萌发率及附着胞形成率和致病性进行测定。利用生物信息学 软件 ProtComp 9.0 和 TMHMM 对 GcAP1 β蛋白进行结构分析，并结合 GcAP1 β-GFP 信号观测，进行 GcAP1 β的亚细 胞定位。利用qRT-PCR技术，检测 GcAP1β在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵染阶段的表达量，并检测 CgPG1、 CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和 pelB在野生型菌株和Δgcap1β突变体中的表达量。【结果】GcAP1β基因全长2 321 bp，含有3个内含子，编码720个氨基酸。与野生型菌株W16相比，Δgcap1β突变体菌落成褶皱状，菌丝生长速 度明显减慢，而分生孢子产量、分生孢子萌发率、附着胞形成率无显著差异。Δgcap1β致病力明显降低，仅在苹 果叶片上引起极小的点状斑。GcAP1β基因恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β完全修复了因 GcAP1β基因缺失造成的表 型缺陷。荧光检测显示，融合蛋白GcAP1 β-GFP分布于细胞质中。qRT-PCR检测结果表明，GcAP1β在苹果炭疽叶 枯病菌各个发育阶段都有表达，且在侵染后表达量相对最高。GcAP1β的缺失导致CgPG1 表达量降低至20.3%，CgPG2 表达量降低至 16.5%，pnl-1 表达量降低至 8.2%，pnl-2 表达量降低至 14.4%，pelA 表达量降低至 4.4%，pelB 表 达量降至0.8%。【结论】衔接蛋白GcAP1复合体分布于细胞质中，是苹果炭疽叶枯病菌生长发育所需要的；GcAP1 调控 CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA 和 pelB的表达，是苹果炭疽叶枯病菌一个重要的毒力因子。 关键词：衔接蛋白；果胶酶；苹果；炭疽菌；致病力 Gene Cloning and Functional Analysis of GcAP1 Complex Beta Subunit in Glomerella cingulata ZHANG JunXiang, JI ZhiRui, WANG Na, XU ChengNan, CHI FuMei, ZHOU ZongShan (Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng 125100, Liaoning) Abstract: 【Objective 】 The objectives of this study