减毒痘苗病毒天坛株的构建、致病性及免疫原性研究.pdf

中文摘要 减毒痘苗病毒天坛株的构建、致病性和免疫原性研究 痘苗病毒天坛株作为疫苗，在我国消灭天花的历史上居功至伟。近年来，痘 苗病毒天坛株作为活病毒载体在预防艾滋病、狂犬病和流感等传染病方面取得了 巨大成就。然而，颅内接种实验表明，痘苗病毒天坛株对小鼠的致死率较高，具 有一定的神经毒性。临床接种痘苗病毒天坛株疫苗也可能导致少数接种者出现严 重副作用，例如脑炎、结膜炎、心肌炎及全身性发痘等。因此，如何构建更加低 毒、更加安全且高效的痘苗病毒天坛株疫苗或载体成为研究的热点。 通过同源重组和 Cre-LoxP 技术，定点敲除痘苗病毒基因组中的复制非必需 基因，是构建减毒疫苗或载体的有效方法。基因重组作为基因工程的重要技术之 一，包括同源重组、位点特异性重组以及转座重组。同源重组技术，又叫基因打 靶技术，是目前研究痘苗病毒基因功能、构建减毒型痘苗病毒疫苗和载体的主要 方法。该技术通过构建含有左右重组臂、启动子和筛选标记基因的穿梭载体，使 病毒基因组与外源 DNA 序列发生重组，进而定点修饰或缺失基因组上某一目的 基因，构建缺失型痘苗病毒。进而，通过体外和体内实验对缺失型痘苗病毒的生 长动力学、病毒粒子表型、细胞间传播能力、毒力、宿主范围和免疫原性等特性 进行系统分析。在构建缺失型毒株的过程中，通常需要引入筛选标记基因，用于 病毒筛选。然而，筛选标记基因作为外源基因的存在不符合商业疫苗生物安全的 要求，在研究过程中需要将其删除。Cre-LoxP 系统作为一种特异性重组技术， 能够定点将外源基因删除，广泛用于重组病毒、细菌和转基因动物等的研究。 Cre 重组酶能够特异性的识别 LoxP 位点（两个反向重复序列）和其间的间隔区 域。当两个同向 LoxP 序列位于同一条 DNA 链上，Cre 重组酶能有效切除位于两 个 LoxP 序列之间的序列。 本研究基于传统痘苗病毒天坛株，分别构建了缺失 TC7L-TK2L 基因 （15,262~25,450）和 TA35R 基因（138,881~139,570）的弱毒株vMVTT1 、vMVTT2 和 vMVTT3 。其中，TC7L-TK2L 基因包括 TC7L、TC6L、TC5L、TC4L、TC3L、 TC2L、TC1L、TN1L、TN2L、TM1L、TM2L、TK1L 和 TK2L 共 13 个片段。 vMVTT1 缺失了 TC7L-TK2L 基因，vMVTT2 缺失了 TA35R 基因，vMVTT3 同 I 时缺失了 TC7L-TK2L 和 TA35R 基因。通过体内和体外实验对缺失型病毒的生长 动力学、细胞间传播能力、病毒表型、毒力下降水平、宿主范围以及免疫原性进 行了分析。首先，在 BHK-21 、Vero 、MDCK 、HeLa 和 PK15 五种细胞中，通过 结晶紫染色实验和 MTT 实验等多种方法分析了缺失型毒株 （vMVTT1 、vMVTT2 和 vMVTT3 ）和野生型VTT 在细胞间传播能力、复制能力、病毒表型及细胞毒 性和宿主范围之间的差异，并对缺失毒株的遗传稳定性进行了评估。然后，通过 鼻内和颅内感染途径分别用 vMVTT1 、vMVTT2 、vMVTT3 和野生型 VTT 感染 小鼠，通过统计小鼠体重下降程度和死亡情况分析缺失 TC7L-TK2L 基因和 TA35R 基因后天坛株痘苗病毒毒力下降水平；用缺失型毒株通过皮内途径感染 家兔，观察家兔接种部位病灶变化大小和程度，进一步分析缺失型毒株对皮肤的 损伤程度及其毒力下降水平。最后，分别用 vMVTT1 、vMVTT2 、vMVTT3 和野 生型 VTT 接种 BALB/c 小鼠，检测血清中 IL-2、IL-4、IL-10 和 IFN-γ 的含量和 特异性抗体水平，并进行攻毒保护实验，分析小鼠的免疫水平，进而评价 vMVTT1 、vMVTT2 和 vMVTT3 的免疫原性。 结果表明，通过同源重组和 Cre-LoxP 系统，成功构建了缺失 TC7L-TK2L 基因和 TA35R 基因且不含外源基因的减毒痘苗病毒天坛株 vMVTT1 、vMVTT2 和