实时荧光定量PCR在临床及科研中的应用.ppt

主要内容 定量PCR通过Ct和初时模板量的关系进行定量。 同一样品的96个重复的终点荧光强度差别很大，但是Ct相同。 Real Time PCR 检测方法 Real-Time PCR检测原理(SYBR Green I法) SYBR Green I 与dsDNA结合 SGI 与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍 随着产物的积累，越来越多的SGI与dsDNA 结合， 使得荧光信号增强. SYBR Green I PCR检测的特点 优点 仅需要一对引物，实验设计简单。 扩增后可进行产物的熔解曲线分析，以确定特异性。 实验成本低。 不足 特异性仅由引物保证。 非特异性双链DNA也会产生荧光信号。 不能用于多重Real-Time PCR。 SYBR Green I法vs Probe法 SYBR Green I 法 优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。 缺点：引物要求高(要求特异性扩增)、不能进行多重PCR。 Probe法 优点：特异性强，能进行多重PCR。 缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。 使用SYBR Green I 进行检测的问题点 Real Time 进入 SYBR Green I 时代 基线平整 Negative control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽 Real-Time PCR 在临床及科研中的应用 微生物及病原体临床检测 病毒粒子定量检测 细菌定量检测 转基因拷贝数检测 肿瘤研究 基因表达研究 基因突变及多态性SNP研究 其他…… 特异性产物 非特异产物 引物二聚体 对PCR产物特异性进行分析 融解曲线分析 SNP与表现型的研究 研究举例-1 研究举例-1 鼻咽癌的个体差异 假设前题： IL-12家族基因多态性（IL-12、IL-27）是鼻咽癌个体差异的原因。 实验设计： SNP位点：在IL-12基因上挑选1个基因位点(16974 A/C )；IL-27基因上挑选3个基因位点(-964 A/G, 2905 T/G, 4730 T/C )。 样本组：302个病人 + 310个正常对照 DNA提取：外周血 需要资源： 实时荧光定量PCR仪、4对相物、8条探针等 鼻咽癌的个体差异的结果分析 研究举例-1 正常对照310人：(IL-12基因) AA 98 AC 152 CC 60 鼻咽癌组302人：(IL-12基因) AA 58 AC 165 CC 79 计算P值：P 0.001 结论：IL-12基因16974 A/C 多态性与鼻咽癌可能具有相关性，其中16974 C等位基因可能是鼻咽癌的遗传易感基因 文章发表： Wei YS, Lan Y, Luo B, et al. Association of variants in the interleukin-27 and interleukin-12 gene with nasopharyngeal carcinoma. Mol Carcinog. 2009, 48(8):751-757. (SCI) 研究举例-2 与药效有相的SNP研究 （个性化用药） 如：乙型肝炎病毒前C区/BCP区基因突变检测及意义 1、常同时出现，突变后病毒复制能力增强，HBeAg表达量降低，提示肝损伤及纤维化危险加大。 2、干扰素治疗指标：HBeAg（+）及A1764、T1762突变的患者干扰素治疗效果较好。 A---T G---A 1762 1764 突变位于HBV-DNA加帽信号区的突出处，可破坏HBV-DNA的复制和(或)信号肽的水解，导致HBeAg(-)，病毒复制受到干扰后，有可能提高HBV-DNA整合入宿主染色体的能力，从而致癌。 G---T 1862 常与NT1896伴随，两点同时变异时，病毒有较高的复制水平和较强的传染性。 G---A 1899 1、突变导致HbeAg分泌受阻，二对半检测表现为小三阳，但HBV DNA阳性。前C突变可作为判断HBeAg→抗HBe血清学转换的一个指标，前C突变先于抗HBe(+)出现者，可能是干扰素等药物诱导的转换，反之则可能是自然转换。 2、指导用药：1896位点发生突变，病毒对干扰素的敏感性降低，因此，不应选择该位点突变的患者进行干扰素治疗。 G---A 1896 意义 碱基变异 位点 Real-Time PCR 两种定量方法 2 研究举例-3 (相对定量) 实时荧光定量PCR技术检测鼻咽癌IL-10、 TGF-β1基因的表达 1-6: TGF-β1扩增产物; 7-11: IL-10扩