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第十六章 基因工程和蛋白质工程简介 第一节 DNA重组和基因工程 DNA重组的 技术路线 pBR322质粒的结构 以?噬菌体为载体进行DNA克隆 ?噬菌体感染大肠杆菌的途径 DNA重组体的筛选 pBR322质粒结构 原位杂交法筛选DNA重组体图解 Southern印迹法 Southern和Western印迹法 DNA重组技术的应用 胰岛素原的人工合成 Ti质粒为载体的植物基因工程 第二节 蛋白质工程简介 生物酶工程示意图 蛋白质技术和核酸技术的相互增强 第三节 核酸研究技术简介 DNA测序的基本战略 酶法序列分析的原理 DNA的Sanger测序法(酶法) DNA的测序仪示意图 DNA的化学测序示意图 测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳 引物标记法测序(Dye Primer) 终止法测序(Dye Terminator) 基因文库与cDNA文库 基因文库 cDNA文库 基因文库和cDNA文库的建立 噬菌体为载体的基因文库的构建 聚合酶链式反应（PCR） PCR技术原理示意图 PCR技术的发展与应用 DNA芯片技术简介 DVA芯片工作示意图 1985年Mullis发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中 y一产量; X--扩增效率; n一循环次数。 （2） PCR的应用 （1）PCR的原理 Back 靶序列 变性和引物复姓 循环1 循环2 循环3 变性和引物复姓 链延伸 Tag酶 链延伸 Back ?用于合成特异探针； ?用于DNA的测序； ? 将逆转录与PCR相偶联 （RT-PCR）； ?用于基因定位诱变； ?末知序列的PCR扩增； ?基因组序列的比较研究； ?用于临床诊断。 Back 第一节 DNA重组与基因工程 第二节 蛋白质工程简介 第三节 核酸研究技术简介 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。 一、DNA重组的技术路线 二、基因工程的应用与前景 三、DNA体外重组常用的酶 Home Foreign DNA to be inserted Plansmid vector Joining Recombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromateme Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule Cloning + 1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组 体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定 Back Ti质粒结构 植物冠瘿瘤 Next ?DNA 用限制性内切酶除去中间一段 与外源DNA连接 重组载体的体外包装 带有外源DNA的?噬菌体 太小不能被包装 头部前体 多联体DNA A蛋白 COS COS COS 成熟的颗粒 在宿主细胞内进行DNA的装配过程 Back Back ? 载体特征的直接筛选 ? 菌落的原位杂交 ? 免疫学方法 Back 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活 Back 复印至硝酸纤维素膜上 用NaOH菌体裂解DNA变性 杂交 放射自显影 32P-cDNA 与放射性cDNA杂交的菌落的斑点 细菌菌落 单链DNA结合到膜上 Back DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸