12高效液相.pdf

第十二章制备型高效液相 重点：制备型高效液相的基本 概念，基本参数与其相互关系， 与分析型HPLC的主要区别 液相色谱的发展史  1903年，色谱法问世 俄国植物学家茨维特 1903年3月21 日，大会报告 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用” 1906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述 分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法  1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年， Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B ，获得了1938 6 年的诺贝尔化学奖。  1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液 液分配色谱法，1952年度的诺贝尔奖。  60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制 高效液相色谱法的特点  采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测 器, 从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准 确。  和经典液相色谱相比有以下优点：快速、灵敏度 高、分辨率高、自动化程度高等。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之 间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分 配而达到分离的过程。 固定相—— 柱内填料，流动相—— 洗脱剂。 分离蛋白质类物质时的分离依据： 疏水性  分子大小  等电点  结构特异性 通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化 学性质可以作如下的分类： 分配色谱—— 分配系数 亲和色谱—— 亲和力 吸附色谱—— 吸附力 离子交换色谱—— 离子交换能力 凝胶色谱—— 分子大小而引起的体积排阻 疏水色谱——苯基，辛基等。 金属螯合色谱——镍、铜等 主要分离类型与原理 一、液-固吸附色谱 （liquid-solid adsorption chromatography ） 固 定 相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。 流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对 具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 二、液-液分配色谱 （liquid- liquid partition chromatography ） 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相， 即流动相的极性小于固定液的极性（正相normal phase ），反之， 流动相的极性大于固定液的极性 反相reverse phase ）。 （ 正相与反相的出峰顺序相反； 二、液-液分配色谱 （liquid- liquid partition chromatography ） 固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相： 将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶表面的 游离羟基上。如C-18柱（反相柱）。 三、离子交换色谱 （ion-exchange chromatography ） 固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流 动 相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳 离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离 子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形 式等有关。亲和力大，保留时间长； + + 阳离子交换：R—SO H+M =R—SO M+H