海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析解析.ppt

海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析研究 徐继林 严小军 叶芳挺 刘才才 宁波大学 浙江省海洋生物工程重点实验室 贵阳 2004.9.23 生物激素对生物体的生长发育和繁殖有着重要的生物学意义。 对海洋贝类而言，主要有两类物质，一类是直接作用于相关受体的小分子物质包括肾上腺素（L-Epinephrine,EPI）、去甲肾上腺素（L-Norepine phrine,NEPI）和多巴胺（Dopamine,DOP）等；另一类是甾醇类激素如17β-雌二醇（17β-Estradiol,EST）和孕酮(Progesterone,PG)等，它们通过调控第一类物质的合成代谢和分泌对生物体起生殖调控作用。 实验材料 实验试剂 激素标准品（纯度98%，美国SIGMA-ALDRICH公司）；七氟丁酸酐（Heptafluorobutyric Anhydride, HFBA,）(美国Alltech公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美国TEDIA公司）；其他试剂均为国产分析纯。 实验材料 实验仪器 QP2010 型 GC-MS 联用分析仪，带 AOC-20 自动进样器（日本 SHIMADZU 公司）；30m×0.25mm ×0.25 ?m SPB-1色谱柱（美国 SUPELCO 公司）；固相萃取装置（美国 SUPELCO 公司），C18固相萃取小柱（美国 SUPELCO 公司），冷冻干燥机（韩国ILSHIN公司），超纯水仪（法国MILLIPORE公司）。另外，国产高速分散匀质机、旋转蒸发仪、旋涡混合仪、高速离心机、电子天平等。 实验材料 实验样品 2004年3月购自宁波市场的鲜活野生一龄曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni）和一龄野生褶牡蛎（Ostrea plicatula），解剖后取性腺，用高速分散匀质机匀浆后冷冻干燥备用。回收率实验采用缢蛏(Sinonvacula constricta)肌肉样品，高速分散匀质机匀浆冷冻干燥后备用。 标准溶液配制 样品预处理 GC/MS定量定性分析 1.分析条件 GC/MS定量定性分析 1.分析条件 GC/MS定量定性分析 2.定性分析 五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图 GC/MS定量定性分析 2.定性分析 GC/MS定量定性分析 3.定量分析 GC/MS定量定性分析 4.回收率、精密度测定 工作曲线 回收率和精密度 检测限 根据性噪比为3，用QP2010气相色谱-质谱分析仪随机所载SNRATIO软件，可计算出各标准物浓度为2.5 ng/mL的信噪比，从而根据式MDL=3CN/S计算出仪器的检测限 样品中激素的含量 取0.1 g 左右曼氏无针乌贼和野生褶牡蛎的性腺按上述条件平行测定3次(表4)，各激素含量在未检出到17.92 ng/g 范围内。 衍生条件的选择 由于各种激素分子上都带有两个以上的可衍生基团，所以在不同的温度条件下会有不同的衍生方式，而衍生时间又会影响衍生程度。 提取、纯化条件的选择 不足 5种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图 Epinephrine, C9H13NO3, 183.20 Norepinephrine, C8H11NO3 , 169.18 Dopamine, C8H11NO2 , 153.18 Estradiol , C18H24O2 , 272.38. Progesterone , C21H30O2, 314.46 197 HFBA 除NEPI出现了衍生物的分子离子信号（m/z 953）外，其他激素衍生物的NCI-MS中均未出现分子离子信号，但都出现了[M-HF]-信号（DOP中的721、EPI中的947、EST中的644和PG中的490）,由此也可确定出在所确定的衍生条件下NEPI衍生上了4个7F基团，DOP衍生上了3个7F基团，EPI衍生上了4个7F基团，EST衍生上了2个7F基团，PG衍生上了1个7F基团。 * * 目的意义 为了解它们在生物体内的合成代谢途径以及从环境中富集的程度大小，需要对它们在生物体内含量进行准确灵敏的测定。 由于它们在生物体内含量很小，而研究过程中生物样品数量也很少，所以如果能够将它们通过一定的方法一次性测定出来将有很重要的现实意义。 已经有大量生物体体液或组织中的激素测定报道，但大多是针对